關(guān)于兩種伊紅染液在HE 染色中的選擇探討

何璋海

（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州）

0 引言

蘇木精-伊紅染色法，簡(jiǎn)稱(chēng)HE 染色，業(yè)界最常用的一種組織學(xué)染色法，E 代表Eosin,伊紅，作用是顯示細(xì)胞漿、肌纖維、膠原纖維、嗜酸性顆粒、紅細(xì)胞等組織呈現(xiàn)不同程度的紅色或粉紅色，與胞核染料蘇木精在色澤上形成鮮明的紅藍(lán)對(duì)比，從而清晰的顯示出組織與細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[1]。但實(shí)際工作中，使用醇溶性伊紅進(jìn)行染色，胞漿、肌纖維等結(jié)締組織容易出現(xiàn)伊紅過(guò)染或者染色不均的現(xiàn)象，主要是由于其分化程度難以掌握，導(dǎo)致核漿對(duì)比模糊，而且它揮發(fā)性強(qiáng)，性?xún)r(jià)比不高，不太符合大批量HE 片的制作。針對(duì)存在的問(wèn)題，我們用改良型水溶性伊紅液和醇溶性伊紅液進(jìn)行對(duì)比染色，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

德國(guó)Leica 公司的ST5020 全自動(dòng)HE 染色機(jī)。

1.2 試劑

改良型Harris`蘇木素、0.5%改良型水溶性伊紅液、0.5%醇溶性伊紅液、1%鹽酸酒精、75%酒精、85%酒精、95%酒精、無(wú)水乙醇、苯酚二甲苯混合液[2]、二甲苯。

1.3 試劑配制

1.3.1 0.5%改良型水溶性伊紅液

水溶性伊紅粉末 2.5g，將其溶于500mL 蒸餾水，充分溶解，過(guò)濾。臨用前 每440mL 水溶性伊紅液滴加240 微升冰醋酸，充分混勻。

1.3.2 0.5%醇溶性伊紅液

醇溶性伊紅粉末2.5g，溶于500mL95%酒精，充分溶解，過(guò)濾，臨用前每440mL 醇溶性伊紅液滴加4 滴（約40 微升）冰醋酸。

1.3.3 改良型Harris`蘇木素

將蘇木精5g 溶于50mL 無(wú)水乙醇，硫酸鋁鉀100g 溶于1000mL 蒸餾水中，煮沸溶解，然后將兩液均勻混合至染液呈淡紅色，繼續(xù)加熱煮沸后取出，待30s 后緩慢加入氧化汞，待染液呈深紫色立即置入冰水中，待冷卻至室溫后過(guò)濾[3]。臨用前每440mL 蘇木素添加15mL 冰醋酸，充分混勻。

1.4 染色方法

應(yīng)用我科的常規(guī)活檢組織切片分成A、B 兩組，置于70°c烤箱烤片20min,然后分別在全自動(dòng)染色機(jī)上作HE 染色，但是兩種伊紅染液將設(shè)置不同的程序進(jìn)行染色，如下：

A 組：（1）二 甲 苯5min×2；（2）95% 酒 精5min×2；（3）85% 酒 精3min×1；（4）75% 酒 精1min×1；（5）自 來(lái) 水 洗30s×1；（6）改良型Harris` 蘇木素2min×1；（7）自來(lái)水洗5s×1；（8）1%鹽酸酒精3s×1；（9）自來(lái)水洗10min×1；（10）0.5%改良型水溶性伊紅50s×1；（11）自來(lái)水洗6s×1；（12）75% 酒 精3s×1;（13）85% 酒 精3s×1;（14）95% 酒 精5s×1；（15）苯酚二甲苯5min×2；（16）二甲苯2min×3。

B 組：（1）二 甲 苯5min×2；（2）95% 酒 精5min×2；（3）85% 酒 精3min×1；（4）75% 酒 精1min×1；（5）自 來(lái) 水 洗30s×1；（6）改 良 型Harris` 蘇 木 素2min×1；（7）自 來(lái) 水 洗5s×1；（8）1%鹽酸酒精3s×1；（9）自來(lái)水洗10min×1；（10）0.5%醇溶性伊紅50s×1；（11）75%酒精3s×1;（12）85%酒精3s×1;（13）95%酒精5s×1；（14）苯酚二甲苯5min×2；（15）二甲苯2min×3。

程序完成后，取出染片，用中性樹(shù)膠封片。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 0.5%改良型水溶性伊紅液實(shí)驗(yàn)組

HE 染色結(jié)果顯示胞漿、肌纖維、膠原纖維及嗜酸性顆粒、紅細(xì)胞等組織呈現(xiàn)不同程度的紅色或粉紅色，顏色鮮艷，與藍(lán)色的細(xì)胞核對(duì)比清晰,層次分明。

2.2 0.5%醇溶性伊紅液實(shí)驗(yàn)組

HE 染色結(jié)果顯示顏色稍微暗啞，部分染片伊紅著色不均，核漿對(duì)比不太清晰。

圖1 0.5%醇溶性伊紅染色液 腸組織 10X0.25 倍鏡下圖

圖2 0.5%水溶性伊紅染色液 腸組織 40X0.65 倍鏡下圖

兩種伊紅染液的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比情況

3 討論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)0.5%改良型水溶性伊紅液配制簡(jiǎn)便，不易揮發(fā)，著色速度快，染色時(shí)間容易控制，組織染色均勻，顏色鮮艷。而0.5%醇溶性伊紅液配制繁瑣，易揮發(fā)，分化節(jié)點(diǎn)難控制，容易造成組織染色不均及顏色暗啞，這是歸因于染片前面經(jīng)過(guò)水洗藍(lán)化，水分或多或少帶到醇溶性伊紅這缸染液，隨著染片量的增多，濃度會(huì)不斷稀釋?zhuān)由虾罄m(xù)的75%酒精、85% 酒精都會(huì)對(duì)其起到褪色作用，因此醇溶性伊紅液的分化程度會(huì)比水溶性伊紅難以掌握，還有它的揮發(fā)性強(qiáng)，每次染片前都需要補(bǔ)液，經(jīng)濟(jì)性上也比水溶性伊紅要差。對(duì)于制片工作量大的科室來(lái)說(shuō)，尋找一種高效穩(wěn)定、性?xún)r(jià)比高的伊紅染液實(shí)屬必要，而我們對(duì)傳統(tǒng)型的水溶性伊紅作出改良配制，同樣可以制作出核漿對(duì)比清晰、紅藍(lán)色彩艷麗、層次分明的優(yōu)質(zhì)HE 片，縱觀伊紅液的染色原理得知其屬于酸性染料，在水中電離成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷結(jié)合而使胞質(zhì)染色，所以合理利用冰醋酸來(lái)調(diào)節(jié)伊紅液的PH 值更是胞漿染色是否艷麗的關(guān)鍵步驟，量不足，伊紅僅通過(guò)滲透或彌散作用，伊紅很難著色，而且與組織結(jié)合不牢固，分化后容易褪色；過(guò)量，則使染色體也發(fā)生電離導(dǎo)致其帶正電，造成核漿對(duì)比不清，另一方面也會(huì)抑制伊紅電離導(dǎo)致沉淀，染色失效[4]。

總之，控制好添加冰醋酸的量，改善染色程序，同樣可以使廉價(jià)、配制簡(jiǎn)單的水溶性伊紅做到高效地解決染色不均、核漿對(duì)比不清晰等問(wèn)題，另外，隨著浸染式染色平臺(tái)在各家醫(yī)院病理科的推廣使用，因其成本相對(duì)低以及試劑開(kāi)放等特點(diǎn)[5]，在保證醫(yī)療質(zhì)量的同時(shí)還能提高效益性，特別適用于大批量機(jī)染的制作單位。