臍帶間充質(zhì)干細胞在組織工程中的應用

韓倩倩 曲明悅 李靜莉 王春仁

【提要】 組織工程作為一種新的組織器官修復方法方興未艾，對其種子細胞的研究也從成體細胞更多地轉(zhuǎn)向干細胞。胚胎干細胞、誘導多功能干細胞和多種成體干細胞均被用于構(gòu)建新的組織或器官，如皮膚、骨和軟骨、神經(jīng)、心血管等。本文對臍帶間充質(zhì)干細胞應用于組織工程和再生醫(yī)學中的相關(guān)研究進展進行綜述。

間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)最初是從骨髓單核細胞中分離出來[1]，后從臍帶[2]、胎盤[3]、關(guān)節(jié)滑液[4]、脂肪[5]、胰島[6]、真皮[7]、牙齦[8]、外周血[9]、肩胛下囊[10]等多種組織中獲得。因具有獨特的增殖、多向分化潛能、營養(yǎng)能力、歸巢/遷移和免疫抑制等生物學功能，而日益受到重視[11]，成為組織工程與再生醫(yī)學的理想的種子細胞。

臍帶間充質(zhì)干細胞(Umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)是存在于臍帶中的一類間充質(zhì)干細胞，于2000年在臍帶血(UCB-MSCs)[2]中被發(fā)現(xiàn)，后逐漸從臍帶的華通氏膠(WJ-MSCs)[12]和血管周圍組織(PVT-MSCs)[13]中獲得。UCMSCs表達MSCs共有標志物CD44、CD73、CD90和CD105，并缺乏內(nèi)皮/造血細胞的標志物CD31、CD34、CD45、CD79，此外PVT-MSCs特異性表達內(nèi)皮細胞表面標志物CD146。相對于其他干細胞，UCMSCs的優(yōu)勢在于：①取材簡單方便，取自新生兒臍帶，供應充足，且對供體無傷害[14]；②增殖分化能力強，其體外增殖能力優(yōu)于BMSCs，且不受供體年齡限制[11，15]；③細胞較原始，可表達胚胎干細胞標志物Oct-4、Nanog、Sox-2和ITSN1[16]，但不存在倫理問題；④免疫原性更低，表達低水平的MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子和效應T細胞誘導所需的共刺激分子CD40、CD80、CD86，并表達高水平的能夠抑制免疫細胞增殖分化的分子HLA-G、IDO和PGE2等[17]；⑤具有免疫調(diào)節(jié)作用，可高表達CD200、CD273、CD274等免疫調(diào)節(jié)表面蛋白和IL1β、IL-8、LIF和TGF-β2等細胞因子，在免疫抑制方面優(yōu)于BMSC[11，17-18]。

UCMSCs參與人體修復的方式主要有：細胞分化、免疫調(diào)節(jié)、分泌多種細胞因子。現(xiàn)階段，UCMSCs越來越多地參與組織器官的重建，本文針對臍帶間充質(zhì)干細胞在組織工程與再生醫(yī)學中的應用進行綜述。

1 在骨再生領(lǐng)域的應用

因BMSCs使用的諸多限制[19-20]，UCMSCs在骨修復和再生領(lǐng)域被大量研究，以期作為BMSCs的替代物。UCMSCs的體內(nèi)外成骨分化能力已被證實[21]。DAY等[22]比較了BMSCs和UCMSCs在珊瑚羥基磷灰石/碳酸鈣上的成骨能力，雖然從表征、ALP、osteocalcin和Runx2的表達等方面均顯示出BMSCs的優(yōu)越性，但UCMSCs依舊能成功進行體外成骨分化。Diao等[23]將UCMSCs載入nHAC/PLA仿生骨支架材料，皮下植入BALB/c裸鼠背下4～12周，結(jié)果顯示在裸鼠體內(nèi)成骨且源自UCMSCs。Ciavarella等[24]從基因水平證明UCMSCs具有和BMSCs相同的成骨機制，即可高表達成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2的共同激活因子TAZ，從而促進新骨形成。Panepucci等[25]表示，盡管hUCMSCs在表達成骨有關(guān)的基因方面不如BMSCs，但可通過金屬蛋白酶和血管生成表達更多參與基質(zhì)重塑相關(guān)的基因，參與組織重建。Wang等[26]將hUCMSCs接種在生物功能化大孔磷酸鈣骨水泥(CPC)上，體外培養(yǎng)14 d后植入8 mm全厚度顱骨缺損大鼠模型，12周后進行Micro CT、免疫組化和組織形態(tài)學分析，顯示hUCMSCs聯(lián)合CPC能顯著增加新生血管和新骨的再生。此外，hUCMSCs與聚乳酸-乙醇酸納米粒聯(lián)合植入也能到達良好的效果[27]。Ye等[28]建立了兔股骨髁缺損模型，植入加載hUCMSC的自組裝仿生礦化膠原支架，提高了骨缺損的愈合速度。相關(guān)研究表明，RGD功能化聚氨酯支架[29]、含GHK肽的氧化海藻酸水凝膠[30]均能通過基因表達、ALP活性和骨細胞外基質(zhì)沉積等促進hUCMSCs的成骨分化。

2 在軟骨再生領(lǐng)域的應用

hUCB-MSCs在軟骨分化和損傷修復中顯示出優(yōu)良的效果。研究顯示hUCB-MSCs培養(yǎng)在Ⅰ/Ⅲ型膠原海綿中可成功分化為軟骨細胞，并表達Ⅱ型膠原蛋白[31]。將hUCB-MSCs混合4%透明質(zhì)酸水凝膠后，分別植入大鼠[32]、兔[33]、豬[34]的雙膝股骨滑車處全厚度關(guān)節(jié)軟骨缺損部位，組織學和形態(tài)學上均顯示出優(yōu)越的軟骨修復能力，沒有骨轉(zhuǎn)化和修復退化的跡象。Kim[35]將UCB-MSCs接種于特制的細胞凝聚誘導網(wǎng)支架，體外軟骨分化顯示糖胺聚糖合成明顯增多，軟骨生成標志物表達明顯上調(diào)，兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中也顯示了有效的軟骨修復。Jeong等[36]通過兔全層軟骨損傷模型，驗證了hUCB-MSCs修復軟骨缺損的旁分泌機制，即在病變區(qū)微環(huán)境刺激下，激活Notch信號通路，TSP-2分泌增加，促進內(nèi)源性軟骨生成細胞的分化。

hWJ-MSCs也是軟骨組織工程中干細胞的替代來源。將hWJ-MSCs植入海藻酸/透明質(zhì)酸水凝膠，在不添加生長因子的情況下培養(yǎng)28 d，即可顯示強烈上調(diào)的軟骨特異性轉(zhuǎn)錄表達[37]。Zhang等[38]用加載hWJ-MSCs的脫細胞軟骨細胞外基質(zhì)定向支架修復山羊的全厚度股骨髁關(guān)節(jié)軟骨缺損，結(jié)果顯示，與單純支架組相比，hWJ-MSCs組的軟骨質(zhì)量較高，軟骨下骨完整；組織學染色顯示，hWJ-MSCs組細胞外軟骨、軟骨腔隙和Ⅱ型膠原水平更高，并且具有更高的彈性模量。此外，類黃酮修飾的3-氨基丙基-三乙氧基硅烷支架[39]、絲素/透明質(zhì)酸支架[40]、殼聚糖-瓊脂糖支架[41]與hWJ-MSCs共培養(yǎng)均能促進hWJ-MSCs向軟骨細胞分化。除了關(guān)節(jié)軟骨修復，將hWJ-MSCs加載在含RTGF-β3的核殼型納米纖維支架上也表現(xiàn)出良好的生物相容性，后者有望用于構(gòu)建氣管軟骨再生組織工程支架[42]。

3 在皮膚再生領(lǐng)域的應用

皮膚創(chuàng)傷修復是一項重大挑戰(zhàn)，創(chuàng)傷、燒傷、感染、糖尿病足部潰瘍等多種損傷均能破壞皮膚的正常結(jié)構(gòu)。傷口愈合是一個復雜的過程，包括炎癥、增殖和重塑。UCMSCs對促進傷口修復具有強大的作用。UCMSCs可分化成表皮樣細胞[43]、真皮乳頭樣組織[44]、汗腺樣細胞[45-46]等，也可通過旁分泌機制促進正常皮膚成纖維細胞的增殖和遷移，上調(diào)再上皮化、新生血管化和纖維增生的基因表達，促進全厚度皮膚切除模型小鼠的傷口愈合[47-48]。

應用膠原-殼聚糖激光-ADM復合材料加載微膠囊化VEGF基因修飾的hUCMSCs修復豬的皮膚傷口缺損，結(jié)果顯示其能改善組織工程真皮的血管化，加速創(chuàng)面愈合[49]。明膠-甲基丙烯酸水凝膠中包裹UCMSCs和臍靜脈內(nèi)皮細胞構(gòu)建三維共培養(yǎng)體系，細胞增殖、細胞外基質(zhì)沉積和血管生成基因的表達在體外均得到了顯著改善，可與宿主組織良好整合并增強了角質(zhì)形成細胞的增殖和分化[50]。殼聚糖水凝膠-hWJMSCs復合物治療雄性大鼠背部皮膚8 mm深的圓形傷口，不同時間點的組織學觀察表明，其能顯著減少TNF-α和IL-1β等炎癥因子分泌，抑制過度炎癥；提高膠原沉積和角質(zhì)形成細胞成熟標志物k1(keratin 1)的表達，促進傷口閉合、微循環(huán)、組織重塑、再上皮化和毛囊再生[51]。此外，海藻酸鈣凝膠多孔支架[52]、脫細胞真皮基質(zhì)[53]、SIS水凝膠[54]等支架與UCMSCs復合均有良好的促進皮膚愈合的效果。上述研究表明，UCMSCs可促進新生血管、再上皮化和上皮化后皮膚附屬物的生成，未產(chǎn)生與治療相關(guān)的嚴重并發(fā)癥或不良反應，在皮膚再生中有巨大的應用潛力。

4 在心血管再生領(lǐng)域的應用

UCMSCs在血管重塑和移植方向有明顯優(yōu)勢。UCMSCs有較高的增殖能力[55]和優(yōu)于BMSCs的血管生成能力[56]。UCMSCs可高表達金屬蛋白酶和血管生成相關(guān)的基因和蛋白[25]，其外泌體以劑量依賴的方式促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和成管，并通過Wnt4誘導內(nèi)皮細胞中β-連環(huán)蛋白的活化發(fā)揮了促血管生成的作用，促進了大鼠皮膚燒傷模型的傷口愈合和血管生成[57]，證明其可通過旁分泌促進血管生成。此外，hUCMSCs可分化成內(nèi)皮樣細胞，形成的毛細血管網(wǎng)絡有更高的總小管長度、直徑和面積[58]；在TGF-β1的刺激下可以分化成血管平滑肌細胞，在體外表現(xiàn)出收縮能力，在體內(nèi)可支持血管結(jié)構(gòu)的形成，并可遷移至去細胞化的小鼠主動脈中，產(chǎn)生血管平滑肌層[59]。

Zhang等[57]證明，hUCMSCs外泌體mir-675包裹在絲素水凝膠中可促進小鼠缺血后肢的血液灌注。Ghorbel等[60]用豬小腸黏膜下層聯(lián)合hUCB-MSCs衍生的VSMCS替換仔豬的肺動脈，6個月后移植處由均勻的內(nèi)皮和多層肌肉組成，而單純支架組則表現(xiàn)為斑塊狀內(nèi)皮細胞層和較薄的肌肉層，顯示hUCB-MSC重塑血管的正向作用。Yang等[61]把hUCMSCs作為非心肌細胞成分，與心室肌細胞、3D大孔氧化鐵支架共同構(gòu)建人心室特異性心臟組織，體外可表現(xiàn)正常的電生理，植入急性心肌梗死大鼠梗塞部位可有效促進受損心臟功能的恢復，顯著改善左心室功能、梗死面積、血管密度和細胞增殖。

5 在神經(jīng)再生領(lǐng)域的應用

hUCMSCs可分化成神經(jīng)樣細胞[62-64]，并表達多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進受損神經(jīng)的恢復[65]。其外泌體通過下調(diào)TNF-α、MIP-1α、IL-6和IFN-γ等炎性細胞因子，可減輕損傷區(qū)域的炎癥，促進脊髓損傷愈合和功能恢復[66]。體內(nèi)注射該外泌體可明顯恢復脊髓損傷大鼠的后肢運動功能，使神經(jīng)絲陽性纖維長度增加，病變部位周圍生長錐狀結(jié)構(gòu)改善，并產(chǎn)生大量神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。Pan等[67]的研究表明，將hUCMSCs加載在負載神經(jīng)生長因子的肝素化膠原支架上，可使兔喉返神經(jīng)損傷處的電生理學、組織形態(tài)學、蛋白表達和疼痛水平接近正常。Jiao等[68]以hUCMSCs結(jié)合絲素/海藻酸鹽/膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子支架修復脊髓損傷，結(jié)果顯示可明顯減輕炎癥反應，增強脊髓瘢痕擴展，增加存活神經(jīng)元數(shù)量，恢復開放性運動功能。此外，Bahrami等[69]證明，異嗎啡胺作為SHH信號激活劑，可促進WJ-MSCS在PCL支架上向運動神經(jīng)元樣細胞分化，為組織工程修復神經(jīng)提供思路。

6 在肝臟再生領(lǐng)域的應用

UCMSCs可分化成肝樣細胞[70-71]，在3D支架中培養(yǎng)的細胞分化增強，可改善細胞形態(tài)、肝臟標志物表達和代謝活性[72]，且在三維的豬脫細胞肝支架中培養(yǎng)比傳統(tǒng)單層培養(yǎng)具有更低的免疫原性表型和更高的免疫抑制能力[73]，顯示UCMSCs結(jié)合組織工程支架比單純細胞治療更具優(yōu)勢。UCMSCs通過旁分泌機制可改善大鼠肝纖維化[74-75]，其分泌體MFG-EGF-8能強烈抑制TGFβ信號轉(zhuǎn)導，減少小鼠細胞外基質(zhì)沉積、肝纖維化和急性肝衰竭[76]。早期外周靜脈輸注UCMSCs可顯著抑制急性肝衰竭猴循環(huán)單核細胞在肝臟的聚集和成熟及IL-6分泌，改善其肝臟組織學、系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)和生存率[77]。Su等[78]在聚(3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯-co-3-羥基己酸酯)支架上加載UCMSCs 或UCMSCs源性肝細胞樣細胞，植入肝損傷小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能顯著促進損傷肝臟的恢復，28 d后顯示出與正常肝臟相似的組織結(jié)構(gòu)。Chetty等[79]首次用近紅外熒光納米晶體對UCMSCs進行快速標記，開發(fā)出具有98%標記效率的新型納米生物結(jié)合物，與氧化鋅NCS結(jié)合經(jīng)尾靜脈注射到對乙酰氨基酚誘導的肝損傷BALB/c小鼠模型中，3 d內(nèi)未觀察到明顯的炎癥、壞死或凋亡，顯示了UCMSCs的肝臟再生功能。

MSCs在組織工程與再生醫(yī)學中的應用價值已經(jīng)得到肯定，但仍面臨許多問題與挑戰(zhàn)：①干細胞的培養(yǎng)、冷凍保存、臨床應用需要標準化，如嚴格的無菌培養(yǎng)，避免異種或成分不明的培養(yǎng)基成分，用無血清培養(yǎng)基代替含血清培養(yǎng)基、優(yōu)化冷凍保存的方法和標準化的大規(guī)模生產(chǎn)等；②完善干細胞的質(zhì)量控制方法，細胞表面標志物有待建立新的標準[80-81]；③組織修復的作用機制需進一步闡明。總體而言，UCMSCs對多種組織的修復都具有良好的效果，有望結(jié)合支架材料后實現(xiàn)組織的修復和再生，在組織工程與再生醫(yī)學領(lǐng)域具有良好的廣闊的應用前景。