宮頸癌組織miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達變化及其臨床意義

杜秀鑾，戴欣，趙海峰，郭凌川，顧棟樺

1 南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院，江蘇蘇州215153；2 蘇州大學附屬第一醫院

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤之一，是女性主要的惡性腫瘤相關死亡原因之一[1]。早期宮頸癌往往不發生局部浸潤和遠處轉移，治療效果較好。但宮頸癌早期發現率較低，大部分患者出現明顯癥狀就診時已進入中晚期，錯過了最佳治療時機[2]。目前，手術切除仍然是宮頸癌最主要的治療手段，但中晚期患者往往伴有局部浸潤和淋巴結轉移，預后較差[3]。分子靶向治療是近年新興的一種腫瘤治療手段，能夠高度選擇性地殺滅腫瘤細胞，安全性和耐受性均較好。但宮頸癌發病的分子機制尚不完全清楚，缺少相應的分子治療靶點。因此，需要深入探索宮頸癌發生、發展的分子機制，從而尋找其分子治療靶點，以便更好地指導臨床治療。微小RNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度為18～22個核苷酸，在真核細胞中普遍存在。miRNA具有多種生物學功能，如沉默mRNA與目標mRNA互補結合進而抑制蛋白質翻譯。近年研究發現，miRNA在多種惡性腫瘤組織中異常表達，可參與惡性腫瘤的發生、發展。miR-769-5p是miRNA家族的重要成員，其基因定位于人染色體19q13.32，編碼蛋白具有調控細胞增殖、分化的作用。有研究證實，miR-769-5p在多種惡性腫瘤細胞中存在異常表達現象，如非小細胞肺癌、肝細胞癌[4]。核仁紡綞體相關蛋白1(NUSAP1)基因定位于人染色體15q15.1，其編碼蛋白能夠參與細胞有絲分裂的紡錘體裝配[5]。近年研究發現，在非小細胞肺癌細胞中NUSAP1表達上調，過表達NUSAP1能夠加速細胞周期G2/M期，從而促進腫瘤細胞增殖，導致腫瘤惡性進展。有研究認為，miR-769-5p可通過負向調控NUSAP1表達參與腫瘤惡性進展[6]。2016年8月—2019年8月，本研究檢測了miR-769-5p、NUSAP1 mRNA在宮頸癌組織中的表達，并探討其表達與患者臨床病理特征以及二者之間的關系，旨在尋找宮頸癌潛在的分子治療靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 以同期在南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院和蘇州大學附屬第一醫院住院的，并經組織病理檢查確診的106例宮頸癌患者為研究對象。納入標準：①符合宮頸癌診斷標準；②接受宮頸癌根治性切除術；③既往未接受手術、放化療或免疫治療等抗腫瘤治療。排除標準：①合并其他宮頸良惡性疾病者；②合并其他全身感染性疾病者；③合并免疫功能缺陷性疾病者；④合并精神障礙性疾病者。患者年齡33～74(50.4±2.2)歲，其中<50歲55例、≥50歲51例；腫瘤直徑：<2.5 cm 58例，≥2.5 cm 48例；病理類型：腺癌26例，鱗癌80例；組織分化程度：低中分化46例，高分化60例；FIGO分期：Ⅰ、Ⅱ期85例，Ⅲ、Ⅳ期21例；有淋巴結轉移44例，無淋巴結轉移62例。本研究經南京醫科大學附屬蘇州科技城醫院和蘇州大學附屬第一醫院倫理委員會審核，患者或其家屬知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達檢測 采用RT-qPCR法。取宮頸癌組織及其配對的癌旁組織(距腫瘤組織邊緣>2 cm并經組織病理檢查證實為正常宮頸組織)各約50 mg，TRIzol法提取組織總RNA，然后將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，按PCR擴增試劑盒說明進行PCR擴增。所有引物由北京睿博科技有限公司設計合成。引物序列：miR-769-5p上游引物5′-TTGAATGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAACCCATG-3′、下游引物5′-TGGAGCTGGGTGAGACCTCTGGGTTCTG-3′，內參GAPDH上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′、下游引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′；NUSAP1上游引物5′-ACCAGACGAGCACCAAGAAG-3′、下游引物5′-ATTGATGGGCTGCTGCTTCA-3′，內參U6上游引物5′-CCACTAGGCGCTCACTGTTCTC-3′、下游引物5′-ACTCCGACCTTCACCTTCCC-3′。按PCR擴增試劑盒說明配制反應體系。miR-769-5p PCR擴增條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s共40個循環；NUSAP1 mRNA PCR擴增條件：95 ℃ 4 min，56 ℃ 1 min、72 ℃ 10 s共40個循環。收集各樣本閾值循環數(CT)值。以GAPDH或U6為內參，以2-ΔΔCT計算目的基因相對表達量。

2 結果

2.1 不同組織miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達比較 宮頸癌組織miR-769-5p相對表達量低于癌旁正常組織，NUSAP1 mRNA相對表達量高于癌旁正常組織(t分別為68.894、56.959，P均<0.01)。見表1。

表1 宮頸癌組織與癌旁正常組織miR-769-5p和NUSAP1 mRNA相對表達量比較

2.2 宮頸癌組織miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 見表2。

表2 宮頸癌組織miR-769-5p、NUSAP1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 NUSAP1 mRNA表達與miR-769-5p表達在宮頸癌組織中的關系 相關分析顯示，宮頸癌組織miR-769-5p表達與NUSAP1 mRNA表達呈負相關關系(r=-0.529，P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，全球每年新增病例超過50萬例，死亡約30萬例[7]。迄今為止，宮頸癌發病的確切分子機制尚不完全清楚。目前，手術切除仍是宮頸癌首選的治療手段，尤其是宮頸癌早期，手術治療效果較好，5年生存率較高[8]。但宮頸癌早期癥狀不典型，部分患者就診時已出現盆腔淋巴結轉移，單純手術治療效果較差，需要聯合放化療或分子靶向治療等。因此，進一步研究與宮頸癌發病相關的分子，才能更好地指導臨床防治。

miRNA是一類非編碼單鏈小分子RNA，長度為18～22個核苷酸，可與靶基因mRNA的3′非翻譯區結合，從而調控基因的表達[9]。近年研究發現，在惡性腫瘤細胞中存在多種miRNA使特定的基因激活或失活，或通過分子支架結合細胞內其他分子，影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等，從而影響腫瘤的發生、發展[10-11]。miR-769-5p是miRNA家族成員之一，其基因定位于人染色體19q13.32。有研究發現，miR-769-5p可作為一種抑癌基因，在惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮重要的生物學調控作用。有研究報道，miR-769-5p可通過靶向抑制轉化生長因子受體1表達，抑制肺癌細胞的增殖和遷移[12]。但miR-769-5p在宮頸癌中的作用機制尚不完全清楚。本研究發現，在宮頸癌組織中miR-769-5p低表達，并且其表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、FIGO分期密切相關，提示miR-769-5p可能參與宮頸癌的發生、發展。有研究表明，miR-769-5p過表達不僅能誘導腫瘤細胞凋亡，還能抑制腫瘤細胞增殖、遷移以及上皮間質轉化等，從而實現抑制腫瘤生長的作用[13]。腫瘤組織miR-769-5p表達降低能夠促進腫瘤細胞生長、增殖和遷移等，從而促進腫瘤惡性進展。CHEN等[6]研究證實，miR-769-5p在惡性腫瘤的發生、發展過程中可能起抑癌基因作用；miR-769-5p可下調轉化生長因子β1表達，通過抑制癌基因c-Myc表達，抑制膀胱癌細胞DNA的復制和轉錄并誘導其凋亡，從而抑制腫瘤惡性進展。

NUSAP1基因定位于人染色體15q15.1，其編碼蛋白屬于核仁紡錘體相關蛋白家族成員之一。NUSAP1是2003年首次發現的一種微管結合蛋白，其相對分子質量約為5.5 kD，通常定位于核仁中[14]。在功能上，NUSAP1可促進微管聚集、紡錘體和染色體連接，并維持血管束的穩定性[15]。NUSAP1在增殖細胞中表達豐富，而在不可再生組織細胞中幾乎不表達。有研究報道，NUSAP1表達上調能夠加速正常細胞增殖，并促進增殖細胞的有絲分裂。近年研究發現，NUSAP1在多種惡性腫瘤細胞中過表達，如胰腺癌、黑素瘤、白血病等，且其過表達通常與惡性腫瘤細胞的侵襲性增強有關[16]。但目前NUSAP1在宮頸癌中的作用機制研究較少。本研究發現，在宮頸癌組織中NUSAP1 mRNA高表達，提示NUSAP1在宮頸癌的發生、發展中具有一定作用。NUSAP1表達上調能夠激活宮頸癌細胞中BTG2/PI3K/AKT信號通路，促進PI3K、p-AKT表達，增強腫瘤細胞的增殖和遷移能力[16]。有研究報道，NUSAP1高表達可促進TGF-β1信號轉導通路中關鍵的激活因子FAM101B表達，FAM101B能夠促進宮頸癌細胞上皮間質轉化，從而促進腫瘤惡性進展[17]。

本研究還發現，在宮頸癌組織中miR-769-5p表達與NUSAP1 mRNA表達呈負相關關系。目前，二者在宮頸癌中確切的相互作用機制尚不清楚。CHEN等[6]研究發現，miR-769-5p通過與NUSAP1的受體結合區域結合，從而抑制NUSAP1表達，繼而促進膀胱癌細胞增殖。此外，NUSAP1可能亦受miR-769-5p的轉錄后表達調控，當miR-769-5p表達降低時，其對NUSAP1的抑制作用減弱，而NUSAP1表達升高則可促進腫瘤細胞惡性增殖。但在宮頸癌中miR-769-5p與NUSAP1具體的相互作用機制仍需深入研究。

綜上所述，宮頸癌組織miR-769-5p低表達，NUSAP1 mRNA高表達，二者表達呈負相關關系，并與腫瘤組織分化程度、FIGO分期、淋巴結轉移有關。但二者在宮頸癌發生、發展過程中具體的作用機制還需要大樣本、多中心的隨機對照研究進一步證實。