青海正品小秦艽與代用品管花秦艽中龍膽苦苷的含量測定

竇萱，劉靜，賈守寧，王雙璽

(青海省中醫院，青海 西寧)

0 引言

《中國藥典》2015 版收載的秦艽為龍膽科植物秦艽、粗莖秦艽、麻花秦艽、或小秦艽的干燥根[1]。文獻報道[2-7]，主要含有環烯醚萜苷類化合物，其中的主要成分就是以龍膽苦苷。從藥理作用的角度來講，龍膽苦苷在抗炎、升高血糖、調節免疫、鎮痛鎮靜降壓、抗組織胺、抗過敏性休克有顯著作用，是臨床上治療腦脊髓膜炎類風濕性關節炎和風濕性關節炎的主要手段。

管花秦艽Ex Kusnuz.(藏語名稱譯音為解吉那寶)。生長在海拔3500—4500 米的高山潮濕地帶、陰坡草地，青海省均有分布。本研究參考2015 版《中國藥典》一部秦艽中龍膽苦苷測定方法，結合文獻報道相關文獻，所使用的方法主要為HPLC 法，考察了青海正品小秦艽與代用品管花秦艽中龍膽苦苷的含量，為新資源的開發提供資料。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LD-20AT 高效液相色譜儀，PDA 檢測器，日本島津公司開發的Labsolutions LC/GC Version 5.73 色譜數據工作站；昆山市超生儀器有限公司生產的KQ-500DE 型數控超聲波清洗器；METTLER TOLEDO MS105 電子天平；重慶阿修羅科技發展有限公司生產的AXLF1830-2 超純水機。

1.2 材料

龍膽苦苷對照品(批號110770-201515，含量99.1%)購自中國食品藥品檢定研究院。小秦艽和管花秦艽，采自2019年9 月下旬青海省共和縣。所有樣品經青海省中醫院中醫藥研究所鑒定為小秦艽和管花秦艽。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Reprosil 100 C18(5μm，150×4,6mm)；流動相：乙腈-0.%醋酸溶液(9:91)；柱溫：35℃；流速：1.0mL·min-1。

2.2 制備對照品溶液的方法

提取適量的龍膽苦苷對照品，將甲醇加入到溶液中，分別制成每1mL 含龍膽苦苷0.5mg 的溶液，即得。

2.3 制備供試品溶液的方法

取本品粉末，提取的粉末需要過三號篩，重量在約0. 5g左右，稱定過程中保證精確，置具塞錐形瓶中，在其中加入20mL 甲醇，對樣品進行超聲處理，處理過程中頻率設定為頻率40kHz，功率設定為500W，處置時間為30 分鐘，二次稱定重量需要放冷，對于缺失的重量需要用甲醇補足，搖勻，濾過，將續濾液提取出來，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性實驗

龍膽苦苷與樣品中其他組分色譜峰基線分離無干擾。按龍膽苦苷峰計算理論板數需要控制在3000 以上。圖1 為具體研究結果。

2.4.2 線性關系的考察

進行龍膽苦苷對照品溶液精密提取，數量分別為2.5、4、7.5、14、20.5μl，在“2.1”項下色譜條件依次進樣，橫坐標設置為進樣量，縱坐標設置為峰面積，計算回歸方程，龍膽苦苷Y=1482.5X-5.9×105，r2=0.9999。說明在1.219～9.999μg 范圍內龍膽苦苷與峰面積之間的線性關系良好。

2.4.3 精密度實驗

提取龍膽苦苷對照品10μl，重復進樣6 次，計算龍膽苦苷對照品峰面積RSD 的相關指標為0.23%(n=6)，說明儀器自身具有較高的精密度。

2.4.4 穩定性實驗

取同一批小秦艽供試品溶液，分別于0,2，4,8，12,24h 進樣10μl 測定，通過對測定結果進行分析發現龍膽苦苷峰面積RSD 的測定指標為0.20%(n=6)，這也在一定程度上說明了24h 供試品溶液能夠維持穩定。

2.4.5 重復性實驗

取同一批小秦艽6 份，每份的重量控制在0.5g 左右，保證稱定結果的精密性，制備供試液，制備過程中主要按“2.3”項下方法進行測定，研究發現樣品中龍膽苦苷的平均含油量為2.365%，RSD 為1.64%，說明這種方法具有較好的重復性。

2.4.6 回收率試驗

取同一批已知龍膽苦苷含量的小秦艽樣品6 份，每份0.05g，需要保證稱定結果的精密性，將稱取好的樣品放置于具塞錐形瓶內，精密加入對照品溶液( 龍膽苦苷0.4878mg·mL-1)5mL，需要制備供試品溶液6 份，制備過程中所使用的方法主要為供試品溶液制備方法。按“2.1”項下色譜條件測定。結果樣品中龍膽苦苷平均回收率為100.57%，RSD 為2.7%，表明本方法的準確度良好，結果見表1。

表1 回收率實驗結果 n=6

2.5 樣品測定

分別取小秦艽、管花秦艽0.5g，對供試品溶液進行制備，所采用的方法主要為“2.3” 項下方法。分別稱取二者10μl 對照品溶液和10μl 供試品溶液，將高效液相色譜儀注入其中，按測定過程中需要依照“2.1”項下色譜條件，計算樣品中龍膽苦苷的含量。結果見表2、3。

表2 小秦艽中含有的龍膽苦苷濃度測定結果n=2

表3 管花秦艽中含有的龍膽苦苷濃度測定結果n=2

圖1 高效液相色譜圖

3 討論

3.1 本次研究工作的展開過程中，所采用的主要為HPLC法來對正品小秦艽與代用品管花秦艽中的龍膽苦苷的含量進行測定，以Reprosil 100 C18(150×4,6mm，5μm) 反向色譜柱，乙腈-0.%醋酸溶液(9:91)為流動相；檢測波長為254nm；柱溫為35℃；流速為1.0mL·min-1。所分離峰形良好。

3.2 從龍膽苦苷的含量的角度來進行分析，小秦艽和管花秦艽均能夠滿足中國藥典中的相關規定，通過對其平均含量進行統計發現：管花秦艽(6.22%)＞小秦艽(2.37%)，說明代用品管花秦艽具有較高的使用價值。

3.3 通過對相關統計結果進行分析發現，管花秦艽的HPLC圖譜與小秦艽的HPLC 圖譜在很多方面具有一致性，由此能夠初步得出結論，管花秦艽能夠被當作是中藥秦艽的替代性藥品。曹曉燕等，王茹之[7]曾研究了管花秦艽藥物不同部分含有龍膽苦苷量進行，研究發現管花秦艽藥物的根莖部分以及葉子、花的部分龍膽苦苷含量均高于2%。管花秦艽雖未被藥典收錄，但由于在高海拔地區，有巨大的貯量，加之采挖較少，所以有良好的開發價值。