丁氏婦科補(bǔ)腎養(yǎng)血保胎方對流產(chǎn)大鼠相關(guān)激素及子宮肌的影響

李瓊，丁麗仙*，猶昌會，熊玉瑤

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽；2.貴州甕安縣中醫(yī)院，貴州 甕安；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽)

0 引言

先兆流產(chǎn)屬于中醫(yī)“胎漏、胎動不安、妊娠腹痛”的范疇，近年來，發(fā)生率逐年升高，并且發(fā)生的原因諸多，目前西醫(yī)的治療方法主要以補(bǔ)充黃體酮及HCG 為主，而中醫(yī)藥在治療方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢[1]。丁氏婦科第十代傳人、全國第六批老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗繼承指導(dǎo)老師丁麗仙教授多年來自擬丁氏婦科補(bǔ)腎養(yǎng)血保胎方治療先兆流產(chǎn)，取得較好臨床療效，為探求該方的作用機(jī)理，本研究采用SD 大鼠腎虛流產(chǎn)模型，進(jìn)一步探討該方對相關(guān)激素及子宮肌收縮力的影響，結(jié)果報道如下。

1 材料

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠，其中雌鼠80 只，雄鼠40 只，3-4 月齡，體重(280±15)g，由湖南省長沙市天勤生物有限公司提供，許可證證號：SCXK(湘)2014-0011，在在貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物研究所適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，環(huán)境溫度18℃-24℃，環(huán)境良好，進(jìn)食自由。

1.2 藥物與試劑

補(bǔ)腎養(yǎng)血保胎方由黃芪、黨參、炒白術(shù)、川斷、桑寄生、菟絲子、阿膠珠、白芍、甘草、仙鶴草等中藥組成，飲片購于貴州省中醫(yī)院，上述藥物水煎、過濾、濃縮，瓶裝標(biāo)記，放置4-8℃冰箱冷藏備用。羥基脲：北京嘉林藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字1H3080239。保胎靈：(國藥準(zhǔn)字Z22026139)生產(chǎn)企業(yè)：吉林省遼源亞東有限公司。米非司酮純粉劑：廣州市齊云生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：C84-1587-1G，批號：MB1587。大鼠雌二醇(E2)ELISA 試劑盒(E-EL-0065c)、孕激素(Pg)ELISA 試劑盒(E-EL-0090c)、絨毛膜促性腺激素β 肽HCG ELISA 試劑盒(E-EL-R0386c)，試劑均來源于武漢伊萊生物科技有限公司。

1.3 儀器

肌張力換能器：量程：10g，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；生物醫(yī)學(xué)信號采集系統(tǒng)：MedLab-U/8C 北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；計算機(jī)：校中心實驗室設(shè)備科提供；電子天平：：FA1004N 電子分析天平；微型高速離心機(jī)：C2500-R-230V 美國Labnet；全自動酶標(biāo)儀：Multiskan MK3 Thermo scientific；尼康Eclipse 55i/50i 生物顯微鏡；電熱恒溫培養(yǎng)箱：ICV-450 日本ASONE；電熱恒溫水浴鍋：HH-4 數(shù)顯雙列四孔水浴鍋，常州華冠儀器制造有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 動物模型制備

2.1.1 妊娠大鼠模型建立方法

參照《藥理實驗方法學(xué)》[2]：取雌性大鼠陰道分泌物作脫落細(xì)胞檢查，連續(xù)2 周，選出具有顯著且穩(wěn)定動情期雌鼠77只，將該77 只雌鼠與雄鼠按2:1 合籠過夜，次日清晨查看雌鼠陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓視為妊娠第1 天，若無陰道栓者則取陰道分泌物在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)精子也視為妊娠第1 天。

2.1.2 動物分組與腎虛先兆流產(chǎn)動物模型制備

參照《人類疾病動物模型》[3]：將72 只孕鼠隨機(jī)編號分為6 個組，分別為空白對照組、模型組對照、保胎靈組、保胎方高劑量組、中劑量組、低劑量組。除空白對照組外，余組在妊娠第3-12 天，每天下午灌胃羥基脲(450mg/kg)[4]2mL，至妊娠第12 天，于末次羥基脲灌胃6 小時后分別灌米非司酮溶液(RU486)3.75mg/kg2mL[5]，以誘發(fā)SD 孕鼠先兆流產(chǎn)，模型制備完畢。

2.2 給藥方法

自妊娠第3 天始，至第12 天，空白對照組：早晨、下午生理鹽水灌胃分別2mL/次。模型對照組：早晨生理鹽水灌胃2mL/d。保胎靈組：早晨保胎靈0.7g/kg/d 灌胃，2mL/日。保胎方高、中、低劑量組：早晨保胎方水煎劑灌胃分別43.12g/kg/d、21.56g/kg/d、10.78g/kg/d 各2mL。

2.3 觀測指標(biāo)

(1)在體子宮宮縮實驗：妊娠第13 日(灌胃米非司酮24小時后)，麻醉后暴露子宮，將子宮用絲線與肌張力換能器連接，記錄子宮平滑肌運(yùn)動曲線。觀察子宮收縮張力(g)和頻率(次/20min)。(2)激素測定5%戊巴比妥麻醉后，摘眼球采血。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測：血清孕酮(P)、雌二醇(E2)、β-HCG。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析和處理，實驗結(jié)果以(±s)表示，數(shù)據(jù)方差齊性，呈正態(tài)分布，采用ANOVA 單因素方差分析，組間兩兩比較使用LSD 檢驗，方差不齊時采用Tamhane’sT2 檢驗。

3 結(jié)果

實驗過程中，空白組大鼠不明原因死亡1 只、灌胃死亡1只；模型組大鼠麻醉死亡1 只、灌胃死亡1 只、采集血標(biāo)本溶血剔除1 只、檢測指標(biāo)差異明顯剔除1 只；保胎靈組麻醉死亡1 只、灌胃死亡1 只、采集血標(biāo)本溶血剔除1 只；保胎方高劑量組大鼠不明原因死亡1 只、灌胃死亡2 只；保胎方中劑量組大鼠麻醉死亡1 只、灌胃死亡1 只、采集血標(biāo)本溶血剔除1 只；保胎方低劑量組大鼠灌胃死亡2 只。

3.1 保胎方對先兆流產(chǎn)大鼠血清E2、P、β-HCG 的影響

與模型對照組比較，空白對照組E2、P、HCG 的濃度均較高(P＜0.05)，保胎方各組、保胎靈組E2、HCG 的濃度明顯升高(P＜0.05)，保胎方中、高劑量組及保胎靈組P 的濃度均升高(P＜0.05)；與保胎靈比較：E2 中保胎方各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，保胎方中、高劑量組P 的表達(dá)、保胎方中劑量組HCG 較保胎靈組高(P＜0.05)；保胎方高劑量組E2 高于中、低劑量組(P＜0.05)；保胎方中、高劑量組P 的表達(dá)、保胎方中劑量組HCG 含量高于低劑量組(P＜0.05)(見表1)。

表1 保胎方對先兆流產(chǎn)大鼠血清E2、P 及β-HCG 的影響(±s)

表1 保胎方對先兆流產(chǎn)大鼠血清E2、P 及β-HCG 的影響(±s)

注：采用LSD 檢驗，與模型對照組比較，#P＜0.05；與保胎靈組比較，ΔP＜0.05；與保胎方中劑量組比較▲P＜0.05，與保胎方低劑量組比較◆P＜0.05。

組別 例數(shù)(只) 劑量[g/(kg·d] E2(Pg/mL) P(ng/mL) β-HCG ( ng/mL )空白對照組 10 — 268.946±33.592# 105.932±10.363# 0.429±0.076#模型對照組 8 — 148.557±34.609 80.156±9.400 0.235±0.061保胎方低劑量組 10 10.780 259.717±31.413# 85.326±8.143 0.329±0.046#保胎方中劑量組 9 21.560 260.219±52.477# 101.883±4.790# △◆ 0.425±0.037# △◆保胎方高劑量組 9 43.120 270.692±47.853#▲◆ 97.525±6.333# △◆ 0.382±0.066#保胎靈組 9 0.700 257.495±34.093# 94.196±11.785# 0.349±0.074#

3.2 保胎方對先兆流產(chǎn)大鼠在體子宮宮縮的影響

與模型對照組比較，空白對照組、保胎方各組和保胎靈組子宮收縮張力及頻率均較低(P＜0.05)；保胎方各組宮縮張力、宮縮頻率與保胎靈組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；保胎方中、高劑量組宮縮張力、高劑量組宮縮頻率均小于低劑量組(P＜0.05)(見表2)。

表2 保胎方對先兆流產(chǎn)大鼠在體子宮收縮張力及頻率的影響(±s)

表2 保胎方對先兆流產(chǎn)大鼠在體子宮收縮張力及頻率的影響(±s)

注：采用LSD 檢驗，與模型對照組比較，#P＜0.05；與保胎靈組比較，ΔP＜0.05；與保胎方低劑量組比較◆P＜0.05。

組別 例數(shù)(只) 劑量[g/(kg·d] 宮縮張力(g) 宮縮頻率(次/20min)空白對照組 10 — 5.274±0.765# 7.190±0.912#模型對照組 8 — 8.344±1.125 11.164±1.535保胎方低劑量組 10 10.780 7.311±1.258# 8.343±1.317#保胎方中劑量組 9 21.560 6.097±1.384#◆ 8.073±1.180#保胎方高劑量組 9 43.120 5.627±0.804#◆ 7.747±0.713#◆保胎靈組 9 0.700 5.658±0.933# 7.568±0.731#

4 討論

丁氏婦科補(bǔ)腎養(yǎng)血保胎方是丁氏婦科第十代傳人丁麗仙教授據(jù)腎氣虧虛、氣血不足、沖任不固之先兆流產(chǎn)所創(chuàng)的保胎經(jīng)驗方，丁教授認(rèn)為其病因為先天稟賦不足，或房勞多產(chǎn)，或孕后房事不節(jié)等。《素問·六節(jié)藏象論》云：“腎者主蟄，封藏之本，精之處也”，《素問·上古天真論》曰：“女子七歲，腎氣盛，……二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子。……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，形壞而無子。”腎藏精，主生殖，胚胎的孕育依賴先天之精，又依賴后天之精血滋養(yǎng)，《傅青主女科》說：“脾健則血旺而蔭胎”。《素問·奇病論》曰：“胞絡(luò)者，系于腎。”沖為血海，任主胞胎，沖任之本在腎，腎之精氣充足，系胎穩(wěn)固；《格致余論·胎自墮論》云：“血?dú)馓摀p，不足榮養(yǎng)，其胎自墮”；腎系胎，脾載胎，血養(yǎng)胎，若腎虛固胞無力，胎失所系，脾虛沖任匱乏，胎失所養(yǎng)，則發(fā)生胎漏、胎動不安、妊娠腹痛，丁教授據(jù)此立方，其藥物組成為黃芪、黨參、炒白術(shù)、菟絲子、桑寄生、枸杞、續(xù)斷、杜仲、白芍、砂仁、阿膠珠、仙鶴草、甘草等，方中桑寄生、菟絲子、杜仲、續(xù)斷、枸杞補(bǔ)腎益精、固攝沖任，腎旺則胎自安；黃芪、黨參、炒白術(shù)、甘草健脾補(bǔ)氣助生化之源，使氣旺以載胎；阿膠珠滋陰養(yǎng)血，止血安胎；白芍養(yǎng)血柔肝，助阿膠珠補(bǔ)血養(yǎng)胎；白芍、甘草緩急止痛安胎；砂仁理氣安胎；仙鶴草收斂止血。全方先后天同補(bǔ)，共奏補(bǔ)腎健脾，養(yǎng)血止血，固沖安胎之功。現(xiàn)代藥理研究表明，菟絲子提高HCG、黃體生成素LH受體功能，改善生殖內(nèi)分泌[6]。白術(shù)抑制興奮的子宮平滑肌，減緩子宮對胚胎的刺激作用[7]。川續(xù)斷總生物堿抑制妊娠大鼠在體子宮平滑肌收縮，降低收縮幅度和張力，對抗0.25U/kg催產(chǎn)素誘發(fā)妊娠大鼠的子宮收縮幅度和張力[8]。杜仲葉沖劑抑制離體大鼠子宮收縮，具有安胎作用。杜仲皮和葉的化學(xué)成分和藥理作用十分相似，可以葉代皮供藥用[9]。芍藥甘草湯有抗炎、鎮(zhèn)痛、解痙作用，能使多臟器平滑肌松弛，解除痙攣[10]。

E2 在孕婦體內(nèi)可使子宮內(nèi)膜增厚，協(xié)助孕激素發(fā)揮作用，并對保持黃體的期限有一定作用[11]；E2 尚有調(diào)節(jié)免疫的作用，降低T 淋巴細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞的排異反應(yīng)。P使子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為蛻膜細(xì)胞，并含有豐富的糖元顆粒供給胚胎營養(yǎng)，防止蛻膜的退變；P可抑制子宮肌的興奮性，降低子宮肌對各種刺激的敏感性，維持妊娠；調(diào)控NK 細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞以抑制免疫反應(yīng)，保護(hù)胚胎不被母體排斥而流產(chǎn)[12]。本研究中模型組血清E2、P水平明顯低于空白組和藥物組，與趙慧茹[13]等、宋芳[14]等的研究相符。保胎方可提高E2、P水平支持胚胎發(fā)育，并降低母體排斥反應(yīng)達(dá)到保胎的作用。

β-HCG 能維持月經(jīng)黃體壽命，使月經(jīng)黃體增大成為妊娠黃體，增加甾體激素的分泌以維持妊娠，將雄激素轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に兀瑫r刺激孕酮的形成；并吸附于滋養(yǎng)細(xì)胞表面以免胚胎滋養(yǎng)層被母體免疫淋巴細(xì)胞攻擊[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)：模型組β-HCG 明顯低于保胎方中、低劑量組，與陳勇等[16]研究相符。保胎方能提高β-HCG 水平達(dá)到保胎的作用，效果優(yōu)于保胎靈。此實驗結(jié)果可能與方中菟絲子、續(xù)斷、桑寄生、阿膠珠等具有雌激素樣活性，提高人絨毛膜促性腺激素含量，促進(jìn)離體培養(yǎng)人早孕絨毛組織HCG 的分泌，改善生殖內(nèi)分泌功能[6]的現(xiàn)代藥理作用有關(guān)。

在妊娠早期，正常的子宮收縮有利于受精和胚胎的著床，增強(qiáng)絨毛間隙和子宮血竇的血液循環(huán)，維持妊娠[16]。若提前出現(xiàn)子宮生理性收縮或強(qiáng)度增加導(dǎo)致囊胚營養(yǎng)吸收不良，甚或絨毛與蛻膜分離剝脫，蛻膜小血管受損，出現(xiàn)絨毛膜下血腫或陰道不規(guī)則流血。本研究結(jié)果表明，保胎方可降低平滑肌收縮頻率和張力，其作用機(jī)制可能為直接作用于子宮平滑肌減少其收縮頻率和張力，也可能為通過提高P含量間接減少子宮平滑肌的張力。該實驗結(jié)果可能與方中續(xù)斷、杜仲、白術(shù)、芍藥、甘草抑制平滑肌收縮的藥理作用有關(guān)。

綜上所述，丁氏婦科補(bǔ)腎養(yǎng)血保胎方可通過提高血清E2、P、β-HCG 的濃度，支持胚胎生長、發(fā)育，同時減少子宮平滑肌收縮頻率、張力，抑制子宮平滑肌異常收縮而有助于胚胎在宮腔內(nèi)繼續(xù)發(fā)育、提高妊娠率。本實驗中，保胎方中、高劑量對多個指標(biāo)的改善有較低劑量好的趨勢，具體的量效關(guān)系需作進(jìn)一步研究。本實驗從對相關(guān)激素及妊娠子宮平滑肌影響的角度，為臨床使用本方提供了科學(xué)依據(jù)，其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。