HPLC法測定排石顆粒中槲皮素和山奈素含量

劉彬果 葉盛英

【摘?要】?目的：建立測定排石顆粒中槲皮素和山奈素含量HPLC法。方法：用ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱;以甲醇-0.4%磷酸（55∶45）為流動相，檢測波長為360 nm。結果：槲皮素在0.025～0.495 μg（r=0.999 9）的范圍內呈良好的線性關系，加樣回收率為97.1%，RSD值2.5%（n=6）;山奈素在0.015～0.304 μg（r=0.999 9）的范圍內呈良好的線性關系，加樣回收率為100.2%，RSD值1.2%（n=6）。結論：該法快速、簡便、準確、重復性好，結果可靠，可用于排石顆粒中槲皮素和山奈素的含量測定，為全面控制排石顆粒的質量提供可靠方法。

【關鍵詞】?高效液相色譜法;槲皮素;山奈素;排石顆粒

【中圖分類號】R284.1?【文獻標志碼】A?【文章編號】1007-8517（2020）19-0052-04

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the content determination of?quercetin and kaempferide in Paishi granules.Methods The content of Quercetin and Kaempferide was determined by HPLC with ZORBAX SB-C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）.The mobile phrase was composed of methanl-0.4% phosphoric acid solution（55∶45）and detected at 360 nm when the column temperature was 25 ℃.Results The linear range of quercetin was 0.025～0.495 μg.The average recovery was 97.1%， RSD 2.5%.The linear range of kaempferide was 0.015～0.304 μg;The average recovery was 100.2%， RSD 1.2%.Conclusion This methods is simple and reliable.It is suitable for the content control of Quercetin and Kaempferide in Paishi granules.

Key?words：HPLC; Quercetin; Kaempferide; Paishi Granules

排石顆粒為第九八三醫院多年的臨床經驗方，由金錢草、海金砂、車前草等9味藥材組成的復方制劑，方中金錢草甘咸微寒，清熱解毒，祛濕熱，退黃疸，利膽排石，為君藥。石韋、海金沙利水通淋，排石;車前草利水并能清下焦濕熱;均為治療淋病的常用藥，為臣藥，其有效成分為槲皮素和山奈素。白茅根涼血止血，清熱利尿;川楝子苦寒性降，行氣止痛;厚樸味辛行散，行氣燥濕;枳殼行氣寬中，化痰除痞，以上四味共為佐藥[1-2]。甘草調和諸藥，以為佐使。其現有的標準只有中藥定性鑒別的方法，沒有主要藥味的含量測定方法，為了更好的控制排石顆粒的質量，采用高效液相色譜（HPLC）法以槲皮素和山奈素作為指標成分進行含量測定，經方法學考察，認為本法簡便，準確，無干擾，可用于排石顆粒制劑的質量控制。

1?儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，OpenLAB CDS色譜工作站，ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱;槲皮素對照品（含量：99.6%，批號：120821-201212）;山奈素對照品（含量： 99.8%，批號：120821-201212）購自中國食品藥品生物制品檢定所;水為超純水（自制），甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。排石顆粒（14430137，15260137，15040115，第九八三醫院制劑室）。

2?方法與結果

2.1?色譜條件?色譜柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;甲醇-0.4%磷酸（55∶45）為流動相;檢測波長為360 nm，進樣量：10 μL。

2.2?對照品溶液的制備?對照品溶液的制備?取槲皮素對照品、山奈素對照品各適量，精密稱定，加80%甲醇溶解，定容，搖勻，制成每1 mL含槲皮素50 μg、山奈素30 μg的混溶液，即得。

2.3?供試品溶液的制備?取排石顆粒（15040115）約7 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，稱定重量，超聲處理60 min（功率250 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液。精密量取續濾液25 mL，置50 mL量瓶中，加入鹽酸（10%）5 mL，置90 ℃水浴中，水解1 h，取出，迅速冷卻，用80%甲醇定容，濾過，取續濾液，即得。

2.4?空白溶液的制備?按處方比例及工藝制備不含金錢草的陰性對照樣品，按2.1項下制備方法得空白溶液。

2.5?專屬性試驗?依據2.1項下色譜條件，分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液及空白溶液各10 μL，測定。結果表明，在與對照品溶液色譜圖相應保留時間處，供試品溶液有槲皮素和山奈素特征吸收峰，而陰性對照液無相應吸收峰，表明專屬性良好。見圖1。

2.6?線性關系的考察?分別精密稱取山奈素10.2 mg（純度：93.2%）、槲皮素對照品15.8 mg（純度：98.0%），置50 mL容量瓶中， 80%甲醇溶解，定容至刻度，即得對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，置25 mL容量瓶中，制備對照品溶液（槲皮素：24.77 μg/mL;山奈素：15.21 μg/mL）。分別精密吸取1 μL、2 μL、4 μL、5 μL、6 μL、8 μL、10 μL、20 μL，依次進樣，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，

得：槲皮素：Y =4263.5X-5.4208，r=0.999 9（n=8）;

山奈素：Y =5942.8X-2.8272，r=0.999 9（n=8）。

結果表明，槲皮素在0.025～0.495 μg的范圍內，山奈素在0.015～0.304 μg的范圍內線性關系良好。

2.7?精密度試驗?精密吸取同一對照品溶液，按2.1項下各色譜條件分別測定，連續進樣6次，記錄峰面積，槲皮素和山奈素的RSD值分別為1.1% 和0.6%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.8?穩定性試驗?同一供試品溶液（15040115），分別于0、2、4、6、8、9 h和10 h測定，得槲皮素和山奈素峰面積RSD分別為2.1%和1.5%，表明供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.9?重復性試驗?同一批樣品（15040115）6份，按2.3項下方法制備，依法測定。記錄峰面積，計算槲皮素和山奈素的含量的RSD分別為1.7%和1.8%，表明該方法具有良好的重復性。

2.10?加樣回收率試驗?取已知含量的樣品（15040115）6份，每份約4.0g，精密稱定，精密加入槲皮素（0.196 mg/mL）和山奈素（0.041 mg/mL）對照品溶液各2 mL，按2.3項下方法制備，按2.1項下條件測定，記錄峰面積，計算回收率，結果槲皮素的加樣回收率為97.1%，RSD為2.5%（n=6）;山奈素的加樣回收率為100.2%，RSD為1.2%（n=6）。見表1、2。

2.11?樣品測定?取樣品3批（14430137，15260137，15040115），按2.2項下方法分別制備供試品溶液，照2.1項下色譜條件測定，外標法定量。計算三個批次的樣品中槲皮素和山奈素的含量，結果見表3。

3?討論

3.1?指標成分的選擇?排石顆粒中金錢草為君藥，主要功效成分為黃酮類 [1-3]，可作為中成藥的質量控制指標，在本研究中，選用黃酮類水解產物槲皮素和山奈素作為指標成分測定，以其含量作為質量控制的考察指標。

3.2?測定波長的選擇?參照中國藥典中金錢草的含量測定方法[4]，經光譜掃描，槲皮素和山奈素在360 nm處均有較大吸收，故選取360 nm作為檢測波長。

3.3?提取條件的選擇?在供試品的制備過程中， 采用超聲提取的方法，該方法簡單，便于操作。同時對于提取時間進行考察，考察了超聲處理40 min、60 min、80 min，研究發現，60 min超聲處理樣品可達到提取完全的目的，采用超聲提取60 min的方法制備供試溶液。

黃酮類化合物在植物體內常與糖結合成苷類或碳糖基的形式存在，為了準確測定其苷元的的含量，需進行水解去糖。參考相關文獻及藥典方法[5-7]，采用酸水解法，考察了糖水解時的溫度、鹽酸含量、水解時間等，采用90 ℃水浴中加熱水解1小時，甲醇與10%鹽酸體積比為5∶1時，峰面積之和達到最大。因而，確定采用超聲60 min，90 ℃水浴中加熱水解1 h制備供試品溶液。

3.4?流動相的選擇?因黃酮類成分含有酚羥基，呈弱酸性，故選擇酸性緩沖系統，參照藥典及相關文獻[8-11]報道，采用甲醇-0.4%磷酸（55：45）為流動相;檢測波長：360 nm;流速：1.0 mL.min-1;柱溫：室溫。可達到很好分離效果。

經方法學考察，本方法簡單，結果準確，重復性好，無干擾，可用于排石顆粒的質量控制。

參考文獻

[1]朱靜，汪正宇.HPLC 測定八珍益母膠囊中槲皮素的含量[J].海峽藥學，2015， 27（7）：37-39.

[2]陳健.高效液相色譜法測定金錢草片中槲皮素和山奈素含量[J].中國藥業，2016，25（6）：62-64.

[3]杜勇，李琰，張小茜.金錢草質量標準的研究[J].中國中藥雜志， 2006，31（5）：438-440.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社， 2015：219-220.

[5]劉譯.HPLC測定利膽消食顆粒中槲皮素和山奈素含量[J].2015，12（1）：27-29.

[6]趙艷麗，黃亦琦，胡珊梅，等.HPLC測定全蠶粉中槲皮素和山奈素的含量[J].中國實驗方劑學雜志， 2012， 18（18）：95-97.

[7]齊惠珍，周霞瑾，田培虹.銀杏葉分散片中總黃酮醇苷的含量測定[J].河北醫藥，2015，37（20）：3178-3180.

[8]馬梅芳，呂文海.HPLC法同時測定南葶藶子飲片中槲皮素、山萘素與異鼠李素的含量[J].中國藥事，2009， 23（5）：65-67.

[9]姜帆，楊星剛，郭迎新，等.銀杏葉制劑溶出度中槲皮素、山萘素與異山李素的HPLC測定方法研究[J].沈陽藥科大學學報，2013，30（9）：691-695.

[10]蔣俊春，孟建升，楊文文.HPLC法測定八味接骨膠囊中山萘素的含量[J].中國藥事，2012，26（12）：1374-1376.

[11]張燕芬.普樂安膠囊中槲皮素和山萘素的HPLC法含量測定研究[J].中國藥物評價，2016，33（3）：136-138.

（收稿日期：2020-05-09?編輯：劉?斌）