布魯氏菌Omp2b蛋白抗原表位的生物信息學分析

李大偉，張峰波，李智偉，江曉明，沙桐，趙驍，陳志強，丁劍冰，

1 新疆醫科大學第五附屬醫院，烏魯木齊830054；2 新疆醫科大學第一附屬醫院；3 新疆醫科大學

布魯氏菌病是由布魯氏菌感染引起的一種人畜共患傳染病，全球每年約有50萬新發病例[1-4]。布魯氏菌病臨床癥狀不典型，極易誤診或漏診，從而造成多系統、多器官慢性損傷，嚴重影響患者生活質量[5-8]。因此，研發針對布魯氏菌的疫苗能夠有效降低布魯氏菌病的發生率，但目前針對布魯氏菌的滅活疫苗和減毒活疫苗還存在諸多不足，如效果不佳、不良反應多[9]。外膜蛋白2b(Omp2b)是布魯氏菌重要的免疫原性蛋白，屬于菌體外膜脂蛋白，存在于已知所有的菌屬中。Omp2b蛋白具有良好的抗原性與免疫原性，可刺激體液免疫，對細胞免疫亦有一定刺激作用。在疫苗研制過程中，Omp2b蛋白被認為是一種較為理想的疫苗分子，近年來受到廣泛關注。但目前關于Omp2b蛋白抗原特異性與表位的研究較少。2017年6月—2019年8月，本研究對布魯氏菌Omp2b蛋白的抗原表位進行了生物信息學分析。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 氨基酸序列：羊布魯氏菌Omp2b，GenBank：AMM72579.1，長度362 bp，蛋白氨基酸序列：MNIKSLLLGSAAALVAASGAQAADAIVAPEPEAVEY-VRVCDAYGAGYFYIPGTETCLRVHGYVRYDVKGGD-DVYSGTDRNGWDKGARFALRVSTGSETELGTLKTFT-ELRFNYAANNSGVDGKYGNETSSGTVMEFAYIQLGG-LRVGIDESEFHTFTGYLGDVINDDVISAGSYRTGKIAY-TFTGGNGFSAVIALEQGGDNDGGYTGTTNYHIDGYM-PDVVGGLKYAGGWGSIAGVVAYDSVIEEWAAKVRG-DVNITDQFSVWLQGAYSSAATPDQNYGQWGGDWAV-WGGLKYQATQKAAFNLQAAHDDWGKTAVTANVAY-ELVPGFTVTPEVSYTKFGGEWKNTVAEDNAWGGIV-RFQRSF。生物信息學分析軟件：ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)，SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)，DNAStar(http：//www.dnastar.com)，IEDB(http：//tools.immuneepitope.org/mhci/，http：//tools.immuneepitope.org/mhcii/，http：//tools.immuneepitope.org/main/bcell/)，SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/)，SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive/)，RasMol2.7.2.1(http：//www.openrasmol.org/)，所有軟件在線獲取。

1.2 方法

1.2.1 Omp2b蛋白理化性質預測 利用ProtParam軟件分析Omp2b蛋白的氨基酸組成、不穩定系數和疏水性等理化性質。

1.2.2 Omp2b蛋白二級結構分析 利用SOMPA在線軟件分析Omp2b蛋白的二級結構特點，如α螺旋、β折疊、β轉角和無規卷曲。

1.2.3 Omp2b蛋白三級結構分析 將Omp2b蛋白氨基酸序列錄入SWISS-MODEL在線服務器，分析蛋白氨基酸序列并組合模板，構建Omp2b蛋白的三級結構，用RasMol2.7.2.1軟件讀取數據并分析其三級結構，明確Omp2b蛋白的穩定性。

1.2.4 Omp2b蛋白B、T細胞表位預測 利用IEDB、DNAStar軟件預測Omp2b蛋白的B細胞抗原表位；利用SYFPEITHI、IEDB軟件預測Omp2b蛋白的T細胞抗原表位。主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類分子選擇HLA-A*1101，MHC Ⅱ分子選擇HLA-DRB1*0701，通過比較分析最終確定Omp2b蛋白的B、T細胞抗原表位。

2 結果

2.1 Omp2b蛋白的理化性質 經ProtParam軟件分析，Omp2b蛋白是一種由362個氨基酸組成的蛋白質，不穩定系數為23.54，疏水性為-0.200，屬于一種穩定親水性蛋白質。

2.2 Omp2b蛋白的二級結構 SOMPA在線軟件分析顯示，在Omp2b蛋白的二級結構中，α螺旋占23.76%，β折疊占27.90%，β轉角占5.80%，無規卷曲占42.54%。見圖1。

圖1 Omp2b蛋白的二級結構分析結果

2.3 Omp2b蛋白的三級結構 RasMol2.7.2.1軟件分析顯示，Omp2b蛋白的三級結構是環狀的，非常穩定，更多β折疊位于蛋白質中間；在蛋白質三級結構的上部和下部存在許多易于形成構象表位的結構。見圖2。

圖2 Omp2b蛋白的三級結構形態

2.4 Omp2b蛋白的B、T細胞抗原表位

2.4.1 Omp2b蛋白的B細胞抗原表位 IEDB在線軟件預測，在Omp2b蛋白的B細胞抗原表位中，蛋白線性表位有11個得分較高區域，其位點分別位于18～34、66～85、93～101、115～131、169～176、184～188、196～212、225～232、268～286、306～316、328～352；蛋白β轉角有10個得分較高區域，其位點分別位于195～222、65～85、110～135、270～291、40～55、168～178、330～345、158～165、183～190、225～232；蛋白表面可及性有12個得分較高區域，其位點分別位于72～82、270～279、62～70、121～129、291～299、197～204、206～213、332～338、341～347、109～115、172～177、306～311；蛋白骨架區柔韌性有11個得分較高區域，其位點分別位于65～85、115～135、90～110、195～210、270～283、335～350、250～260、170～179、150～155、50～57、30～35；蛋白抗原指數有12個得分較高區域，其位點分別位于23～43、4～20、259～271、135～147、316～328、56～66、233～242、228～224、300～306、330～336、190～195、45～50；蛋白親水性有13個得分較高區域，其位點分別位于65～85、113～133、195～215、265～282、340～350、305～315、290～300、90～100、15～22、30～38、40～45、50～55、150～157。

DNAStar在線軟件綜合蛋白的α螺旋、β轉角、表面可及性、骨架區柔韌性和抗原指數五個方面預測Omp2b蛋白的B細胞抗原表位(見圖3)，結合IEDB在線軟件分析的線性表位、表面可及性、β轉角、骨架區柔韌性、抗原指數、親水性六個方面，確定了Omp2b蛋白8個B細胞抗原表位，見表1。

注：A為α螺旋區域，B為β折疊區域，T為β轉角，C為無規卷曲區域。

表1 Omp2b蛋白的B細胞抗原表位

2.4.2 Omp2b蛋白的T細胞抗原表位 采用SYFPEITHI和IEDB在線軟件預測Omp2b蛋白的T細胞抗原表位，以HLA-A*1101預測CTL細胞抗原表位，以HLA-DRB1*0701預測Th細胞抗原表位，結果見表2。經綜合分析，共得到7個CTL優勢表位和3個Th優勢表位，見表3。

表2 SYFPEITHI和IEDB軟件預測的Omp2b蛋白CTL與Th表位

表3 Omp2b蛋白的T細胞抗原表位

3 討論

布魯氏菌病是由布魯氏菌感染引起的一種人畜共患傳染病。布魯氏菌可通過多種途徑傳播，侵襲力和致病力強，臨床癥狀不典型，能夠引起多系統、多器官慢性損傷。近年來，全球布魯氏菌病疫情防控形勢嚴峻，每年大約有50萬新發病例。布魯氏菌病在我國大部分省市自治區有不同程度流行，特別是畜牧業發達地區。新疆維吾爾自治區是全國五大牧區之一，近年來布魯氏菌病的發病率持續上升。布魯氏菌病病情難以控制，存在較多并發癥，如治療不及時易轉入慢性期，反復發作，遷延數年甚至終生不愈，嚴重影響患者的生活質量。因此，布魯氏菌病的防治工作在世界范圍內備受關注。研發針對布魯氏菌的疫苗能夠有效降低布魯氏菌病的發生率，但目前針對布魯氏菌的滅活疫苗和減毒活疫苗還存在諸多不足，如效果不佳、不良反應多[9]。

布魯氏菌的外膜蛋白是近年來的研究熱點。有研究顯示，外膜蛋白屬于保護性抗原，具有免疫原性，布魯氏菌的外膜蛋白不僅是最重要的血清學診斷抗原，也是一個主要的毒力因子。外膜蛋白能夠維持布魯氏菌的正常結構和基本功能，在布魯氏菌生存中發揮重要作用，其功能涉及侵襲、遷移和復制等與生存相關的多個環節。Omp2b蛋白是普遍存在于布魯氏菌中的一種外膜蛋白，相對分子質量為36 kDa。蛋白質組學研究發現，Omp2b作為構成跨膜通道的膜孔蛋白，是主要的外膜蛋白之一。通過生物信息學工具對Omp2b蛋白的B、T細胞抗原表位進行預測，并經動物實驗證實，Omp2b蛋白能夠引起較強的Th1型免疫反應，可作為診斷布魯氏菌病的候選抗原之一。

開發有效的抗布魯氏菌病疫苗是當前階段研究的重點。而疫苗受蛋白結構和功能的影響較大[10]，故探索布魯氏菌Omp2b蛋白的結構和功能對疫苗研發具有重要意義。本研究對Omp2b蛋白的一級結構分析發現，Omp2b蛋白是一種穩定親水性蛋白質。在蛋白的二級結構中，β轉角區域和無規卷曲區域有利于形成表位區域[11]。本研究發現，在Omp2b蛋白的二級結構中無規卷曲和β轉角構成較多。本研究通過SWISS-MODEL軟件預測并構建Omp2b蛋白的三級結構，結果發現Omp2b蛋白是環狀的，非常穩定，其表位主要位于三級結構的上部和下部。以上研究表明，Omp2b蛋白的結構具有疫苗研發所需的特性。

有效的疫苗不僅應具有合理的蛋白結構，還應具有相應的T、B細胞抗原表位。T細胞抗原表位必須能夠加工成與相應MHC結合的肽，然后被TCR識別[12]。T細胞抗原表位分別由CTL和Th細胞識別的MHC Ⅰ、Ⅱ類分子呈遞。布魯氏菌是一種細胞內病原體，細胞免疫在去除致病菌方面起著重要作用[13]。本研究使用SYFPEITHI、IEDB軟件分析了Omp2b蛋白的T細胞抗原表位，由于HLA-A*1101、HLA-DRB1*0701在新疆人群中出現的頻率較高，故以HLA-A*1101預測CTL細胞抗原表位，以HLA-DRB1*0701預測Th細胞抗原表位[14-16]，最后篩選出了Omp2b蛋白7個CTL優勢表位和3個Th優勢表位。B細胞產生的特異性抗體可有效識別病原體并引起隨后的一系列免疫應答。因此，B細胞抗原表位在疫苗研發中具有重要作用[17-18]。本研究通過DNAStar、IEDB軟件確定了Omp2b蛋白的8個B細胞抗原表位。

綜上所述，布魯氏菌Omp2b蛋白具有7個CTL優勢表位、3個Th優勢表位和8個B細胞抗原表位，具有良好的免疫原性。這為布魯氏菌病診斷和疫苗研發提供了一定理論依據。