非小細胞肺癌中反義長鏈非編碼RNA RAB11B-AS1的表達及臨床意義

汪柳，黃培芝，熊將軍

作者單位：湖南中醫藥高等?？茖W校附屬第一醫院（湖南省直中醫醫院）檢驗科，湖南 株洲412000

肺癌是最為常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居全球腫瘤首位，嚴重危害人類的生命健康［1-2］。肺癌的發病機制尚未完全明確，可能與環境污染、吸煙、既往肺部慢性感染、電離輻射和遺傳等因素有關。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%，進展期病人5年生存率僅為15%［3］。尋找治療NSCLC的新途徑，探尋有效的基因治療靶點是目前亟須解決的問題。全基因組分析顯示，人體內超過90%的基因被轉錄為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）。大量研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學行為中發揮作用，并在多種腫瘤中異常表達，在腫瘤的發生發展中發揮抑癌或促癌作用［4-5］。lncRNA可通過表觀遺傳、轉錄及轉錄后多種途徑調控基因表達［6］。反義長鏈非編碼RNA RAB11B-AS1（long non-coding RAB11B antisense RNA，lncRNA RAB11B-AS1）是一種反義lncRNA，能通過不同機制調控基因的表達。研究發現，一些特定的lncRNA在NSCLC中表達異常，與NSCLC發生發展、轉移及預后有密切聯系［7］。然而lncRNA RAB11B-AS1在NSCLC中的作用鮮有報道，本研究將通過檢測NSCLC癌組織中lncRNA RAB11B-AS1的表達及與預后的關系，以期為NSCLC的治療和預后提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2014年9月至2017年3月于湖南省直中醫醫院行手術治療的97例NSCLS病人，其中男/女：54例/43例，年齡（57.31±9.86）歲，范圍為34～79歲。Ⅰ～Ⅱ期/Ⅲ～Ⅳ期：47例/50例，淋巴結轉移有/無：60例/37例，遠處轉移有/無：28例/69例。試驗組為病人的癌組織，對照組則選取同一病人的癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm）。

納入標準：①經病理確認為NSCLC；②入院前3個月未行放、化療；③臨床病理資料完整。排除標準：①肝、腎、心臟等功能不良者；②同時患有其他惡性腫瘤者；③拒絕參與研究者。

對所有病人隨訪2年，從術后第1天起，隨訪日期截至2019年4月1日，無失訪病例，統計隨訪期間的生存人數。97例NSCLC病人中共存活41例，死亡56例。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，病人及其近親屬均知情且同意。

1.2主要儀器與試劑實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）儀（型號T100），購于伯樂生命醫學產品（上海）有限公司；Titan One Tube RT-PCR試劑盒（貨號11939823001），購于Sigma-Aldrich中國上?？偛?；Prime Script?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號 RR037A）及TRIzol試劑（貨號JMS12279），均購于日本TaKaRa公司。

1.3研究方法

1.3.1 樣品采集 于術中收集新鮮的NSCLC癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣大于2 cm），液氮中冷凍后，移至-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 實時熒光定量逆轉錄PCR（RT-qPCR）測定lncRNA RAB11B-AS1的表達 ①提取總RNA：組織破碎后勻漿，按照Trizol RNA提取說明書操作，所得RNA溶于RNase Free水，保證RNA完整，并檢測RNA純度及濃度。②逆轉錄：將RNA逆轉錄為互補DNA（cDNA），按照Prime Script? RT reagent Kit試劑盒說明書操作，-20℃保存所得cDNA。③qPCR反應（20μL體系）：2×SYBR Green PCR Master Mix（10μL），上下游引物（各1μL），cDNA模板（2μL），水（6μL），各樣本均設置3個重復。以GAPDH為內參，其正向引物序列為5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，反向引物序列為5’-GGCTGTTGTCTTACTTCTCATGG-3’；lncRNA RAB11B-AS1正向引物序列為5’-CCATGGACCCTTGCGAGAT-3’，反向引物序列為 5’-CAAAGTCCATGTAAACATGTTCCC-3’。④反應條件：于T100 qPCR儀上進行，95℃30 s、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA RAB11B-AS1相對表達量。

1.4統計學方法采用SPSS 24.0分析，計量資料以xˉ±s表示，采用配對樣本t檢驗；計數資料用例數表示，采用χ2檢驗；Kaplan-Meier曲線繪制NSCLC病人術后24個月的生存曲線；影響NSCLC預后的危險因素采用Cox多因素回歸分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 RT-qPCR法測定組織中lncRNA RAB11BAS1表達量試驗組lncRNA RAB11B-AS1的表達量為（2.61±0.74），對照組lncRNA RAB11B-AS1的表達量為（1.35±0.41），試驗組明顯高于對照組，差異有統計學意義（t＝14.669，P＜0.001）。

2.2癌組織中lncRNA RAB11B-AS1表達與NSCLC病人臨床病理特征的關系以lncRNA RAB11B-AS1表達的平均數值（2.61）將試驗組分為高、低表達組。lncRNA RAB11B-AS1表達與病人年齡、性別、吸煙史及腫瘤直徑無關（P＞0.05），與病理類型、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移和疾病分期有關（P＜0.05）。見表1。

2.3癌組織中lncRNA RAB11B-AS1表達與NSCLC病人預后的關系繪制97例NSCLC病人術后1～24個月的生存曲線，其中生存41例，總生存率為42.27%（41/97）。lncRNA RAB11B-AS1高表達組術后 2年總生存率為 28.30%（15/53），95%CI：13.401～17.542；低表達組術后2年總生存率為59.09%（26/44），95%CI：17.595～21.451，兩組比較log-rank值為9.272，P＝0.002。見圖1。

圖1 非小細胞肺癌97例癌組織反義長鏈非編碼RNA RAB11B-AS1表達24個月生存曲線

2.4影響NSCLC病人預后的危險因素分析單因素分析顯示，病理類型、分化程度、疾病分期、淋巴結轉移、lncRNA RAB11B-AS1表達及遠處轉移是影響NSCLC病人預后的危險因素。多因素分析顯示，lncRNA RAB11B-AS1表達、遠處轉移和疾病分期（HR＝2.69、2.70、2.93，95%CI：1.83～3.96、1.58～4.62、1.67～5.13，均P＜0.05）均是影響NSCLC病人預后的獨立危險因素。見表2。

3 討論

NSCLC多數病人確診時處于NSCLC晚期［8］。晚期NSCLC病人常伴隨淋巴結轉移和遠處轉移，療效不佳［9］。隨著科技的進步和分子生物技術的發展，NSCLC分子靶向治療取得一定進展，但發病機制尚未明確，目前仍缺乏有效的診斷及預后判斷指標［10］。

lncRNA不具有編碼蛋白功能，但可以參與細胞的多種生物學行為，在人體內發揮重要作用。lncRNA主要通過以下途徑參與細胞調控：①影響目的基因啟動子轉錄；②影響RNA聚合酶Ⅱ活性；③與目的基因轉錄本形成互補雙鏈；④與目的蛋白結合影響其活性；⑤改變目的蛋白在細胞中的定位［11］。越來越多研究表明，lncRNA在肺癌的發生發展中起重要作用［12-13］。Meng等［14］發現，lncRNA RMRP在肺腺癌細胞系A546、SPC-A1、H1299和H23中均呈高表達，且其異常表達可促進肺腺癌癌細胞增殖和侵襲。She等［15］研究表明，長鏈非編碼RNA SNHG7可增強Fas凋亡抑制分子2（FAIM2）蛋白的表達，從而促進肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細胞凋亡。

表2 非小細胞肺癌病人97例的預后影響因素分析

根據位置及轉錄方向，可將lncRNA分為5類：雙向、正義、反義、基因間和內含子lncRNA［16］。反義lncRNA含有m7GPPPN結構，可躲避5’-3’核酸外切酶，比其他lncRNA更穩定，并且反義lncRNA亞細胞定位相對自由，其發揮作用的機制更加廣泛［17］。反義lncRNA正在受到人們的廣泛關注。Wu等［18］研究發現，長鏈非編碼RNA GAS5-AS1在NSCLC癌組織中表達下調，且與疾病分期和淋巴結轉移有關，lncRNA GAS5-AS1過表達能夠抑制NSCLC細胞的上皮-間質轉化，發揮抑癌作用。lncRNA RAB11BAS1是RAS癌基因家族成員，定位于19q13.2處，長1 022 bp，有3個外顯子。馮麗萍等［19］研究表明，胃癌組織中lncRNA RAB11B-AS1表達上調，且與病人預后密切相關。Chen等［20］發現，lncRNA RAB11BAS1在骨肉瘤中組織中表達下調，能夠抑制骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。目前，對于lncRNA RAB11B-AS1在腫瘤疾病中的作用研究較少，在NSCLC中的表達情況及作用未見報道。

本研究檢查NSCLC病人癌組織中lncRNA RAB11B-AS1的表達水平，結果顯示lncRNA RAB11B-AS1表達在癌組織中明顯高于癌旁組織，NSCLC病人癌組織中腺癌、低分化、淋巴結轉移、遠處轉移、Ⅲ～Ⅳ期病人lncRNA RAB11B-AS1表達水平明顯高于鱗癌及其他、中高分化、無淋巴轉移、無遠處轉移、Ⅰ～Ⅱ期病人，提示lncRNA RAB11B-AS1表達可能影響NSCLC的發生及病程進展；Kaplan-Meier曲線顯示，lncRNA RAB11B-AS1高表達組的生存率（28.30%）低于低表達組（59.09%），提示lncRNA RAB11B-AS1高表達影響NSCLC病人術后生存率；Cox回歸分析顯示，lncRNA RAB11B-AS1表達、處轉移和疾病分期均是影響NSCLC預后的獨立危險因素，提示下調lncRNA RAB11B-AS1可能對提高NSCLC病人的術后生存率有一定幫助。

綜上所述，lncRNA RAB11B-AS1在NSCLC病人癌組織中上調，其表達與病人臨床病例特征有關，且與NSCLC病人的預后密切相關，可為NSCLC的治療提供參考。