白細胞分化抗原38、白細胞分化抗原138聯合宮腔鏡檢查對反復胚胎移植失敗病人慢性子宮內膜炎的診斷價值

徐漢杰，張雨，鄭圣霞，劉雨生，吳大保，趙衛東

作者單位：1中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院），a婦產科，b生殖醫學中心，安徽 合肥230001；2安徽省婦幼保健院婦產科，安徽 合肥230001

隨著輔助生殖技術的不斷發展，現階段體外受精和胚胎移植一個周期后的妊娠率高達60%，但仍有相當一部分病人出現反復胚胎移植失敗（Repeated Implantation Failure，RIF）。2005年歐洲人類生殖及胚胎協會將RIF定義為3次以上高質量胚胎移植而未妊娠或多次胚胎移植中，合計移植＞10個胚胎仍未妊娠［1］。常見原因是基因異常、內分泌功能障礙、血栓性疾病、自身免疫性疾病、黃體功能不全，但仍有一部分病人無法找到病因［2］。近年，越來越多的生殖遺傳學家認為慢性子宮內膜炎（Chronic Endometritis，CE）與RIF的發生密切相關［3-5］。

CE是一種發生在子宮內膜的慢性炎癥，大多數病人無臨床癥狀或僅表現為異常子宮出血、盆腔疼痛等輕微癥狀，其診斷的必備條件為在子宮內膜間質中存在漿細胞［6-7］。在實際工作中，采用傳統的蘇木精-伊紅（HE）染色難以區分漿細胞與單核細胞及子宮內膜間質的成纖維細胞，已有大量研究指出，白細胞分化抗原38（Cluster of Differentiation 38，CD38）、白細胞分化抗原138（Cluster of Differentiation 138，CD138）能特異的表達在漿細胞的細胞質或細胞膜表面，為CE的診斷提供新的策略。但CE病人無癥狀或臨床癥狀輕微以及子宮內膜組織取材的局限性，導致CE的準確診斷率仍不高。本研究擬初步了解CE在RIF病人中的患病率，同時探討CD38、CD138免疫組化聯合宮腔鏡檢查診斷CE的應用價值，為CE的診斷提供新的策略。

1 資料與方法

1.1一般資料選取中國科學技術大學附屬第一醫院2017年2月至2019年6月RIF病人，納入標準：年齡＜40歲，彩超及子宮輸卵管造影未見明顯異常，行3次或以上胚胎移植失敗或至少累積移植6個高質量的胚胎失敗。排除標準：月經周期第3天卵泡刺激素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH）＞10 UI/L、體質量指數（Body Mass Index，BMI）＞30 kg/m2、反復流產史、子宮內膜增生、子宮內膜結核、黏膜下肌瘤、宮腔粘連、子宮內膜異位囊腫、子宮腺肌癥、免疫性疾病。以上所有病人簽署宮腔鏡檢查知情同意書并在卵泡期（月經干凈3～7 d）行宮腔鏡檢查及子宮內膜活檢術，取出的子宮內膜組織行HE染色及CD38、CD138免疫組化染色，研究方案經安徽省立醫院倫理委員會批準（P-019），所有入組病人已完成必要的輔助檢查，并簽署知情同意書。

1.2宮腔鏡檢查方法病人取截石位，用碘伏消毒外陰及陰道，鋪無菌洞巾，再次消毒宮頸外口，避免擴宮，連接宮腔鏡檢查鏡，全面觀察宮腔，然后觀察子宮內膜是否存在CE征象：子宮內膜點狀、局灶性或者彌漫性充血、子宮內膜細小息肉、子宮內膜血管增粗、子宮內膜黏膜水腫等［8-9］，可予以定點活檢，若未見明顯異常，可予以分散活檢3～5處子宮內膜，獲取子宮內膜組織。

1.3免疫組織化學檢測CD38、CD138的表達使用10%的中性甲醛固定，常規脫水后行石蠟包埋，按2～4μm厚度連續切片，60℃烤箱過夜后脫蠟至水，制作成切片分別進行HE染色及免疫組織化學染色，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法（Streptavidin-Perosidase，SP）法，乙醇梯度脫水后蒸餾水洗，加入檸檬酸抗原高壓修復，高壓鍋冒汽后2 min，室溫冷卻，3%的過氧化氫封閉10 min，加CD38抗體（1∶1 500；HPA022132，Sigma）或 CD138（1∶100；CM167CK，Biocare Medical），4 ℃冰箱過夜，磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）沖洗，加通用型二抗（PV6000工作液），DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明，中性樹脂封片。用PBS液作為一抗為陰性對照。

1.4結果判定CD38定位于細胞膜，出現棕黃色為陽性，CD138定位于細胞膜及細胞質中，出現棕黃色為陽性。在高倍鏡視野下發現有1個以上細胞CD38陽性，同時在相同高倍鏡視野下發現有1個以上細胞CD138表達陽性，診斷為組織病理學CE［10］。

1.5統計學方法采用SPSS 20.0統計軟件分析，計數資料采取例數（%）表示。本研究以免疫組化診斷結果為參考，計算宮腔鏡診斷靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值等指標，并對比宮腔鏡檢測結果與免疫組化診斷結果的一致性（Kappa值）。當Kappa值在0.40～0.75認為兩種診斷方式具有中度至高度一致性，Kappa＞0.75則兩種診斷方式一致性好。

2 結果

2.1 RIF病人宮腔鏡下的表現情況186例RIF病人宮腔鏡下診斷為CE的病人為112例（CE/HS組），呈正常宮腔鏡表現的病人74例（非CE/HS組），詳見圖1。

圖1 宮腔鏡下慢性子宮內膜炎的表現：A為宮腔下子宮內膜充血；B為宮腔鏡下子宮內膜微小息肉；C為宮腔鏡下子宮內膜血管增粗；D為宮腔鏡下子宮內膜間質水腫伴微小息肉

2.2 RIF病人子宮內膜組織CD38、CD138表達情況186例RIF病人子宮內膜組織中CD38呈陽性83例（44.62%），CD138呈陽性 79例（42.47%），CD38、CD138表達均呈陽性77例（41.40%，診斷為組織病理學CE），詳見表1。

表1 反復胚胎移植失敗病人子宮內膜組織CD38、CD138的表達情況/例（%）

2.3宮腔鏡對CE的診斷參數宮腔鏡對CE診斷結果與組織病理學結果具有中度一致性（Kappa＝0.553），靈敏度為94.81%，特異度為64.22%，陽性預測值為65.18%，陰性預測值為94.60%，詳見表2。

表2 宮腔鏡對慢性子宮內膜炎（CE）的診斷參數/例

3 討論

CE是指各種原因引起的子宮內膜炎性改變，其確切病因尚不清楚，現階段普遍認為是細菌、支原體、衣原體等感染引起的。雖然子宮內膜周期性的剝落使感染的病原體排出體外，但是基底層內膜無法周期性剝脫，一旦基底層內膜組織發生長期感染，最終導致CE的發生。Kitaya等［11］對142例RIF病人行子宮內膜活檢，結果發現33.7%的人患有CE，經過有效的抗生素治療后，病人的臨床妊娠率明顯提高。Cicinelli等［8］同樣發現CE病人經過抗生素治療后，病人的胚胎種植率、臨床妊娠率明顯提高，明顯改善其生殖預后。因此早期診斷、準確診斷CE顯得尤其重要。

CE診斷金標準為在子宮間質發現漿細胞，但是單核細胞浸潤、大量有絲分裂的基質細胞、呈類漿細胞樣的基質細胞、月經后期以及活檢取材的局限性，使漿細胞的尋找尤為困難，較易造成誤診、漏診［7，12-13］。因此，尋找新的方法提高漿細胞的檢出率顯得尤為重要。在正常漿細胞中，免疫表型主要表現為CD38、CD138等，漿細胞較為特異的指標為CD138，同時另有研究表明，漿細胞中的CD38分子具有較強的著色力。CD38是轉膜糖蛋白中的Ⅱ型，主要表達于漿細胞，但也表達在活化的T細胞、胸腺細胞；CD138是由核心蛋白和未分枝的糖胺聚糖鏈共價結合形成的一類糖結合物，也是漿細胞特異性標志物之一，表達于活化的β細胞、漿細胞以及胸腺細胞，大約95%石蠟切片的漿細胞表明均有CD138表達。因CD38、CD138不僅僅表達在漿細胞，在臨床實際工作中，采用免疫組化方法聯合檢測CD38、CD138提高對漿細胞的準確識別，該方法對于CE的診斷優于傳統HE染色法，并被學者廣為推薦［14-16］。

Johnston-MacAnanny等［10］獲取33例RIF病人的子宮內膜組織，并使用CD138行免疫組化進行染色，結果發現10例病人表達為陽性，陽性率為30.3%；另一研究顯示，同樣對RIF病人的子宮內膜行CD138免疫組化染色，發現33.7%（142/421）的病人表達為陽性，被診斷為CE［11］。Yang等［17］對202例RIF病人的子宮內膜組織行CD38、CD138免疫組化染色，發現43.6%的病人表達為陽性，診斷為子宮內膜炎。本研究結果顯示，CD38細胞膜強陽性，CD138為漿細胞胞膜強陽性，胞質弱陽性染色，在顯微鏡下相對于HE染色尋找漿細胞更容易，尤其在疑似CE病人標本時，HE染色無法準確辨認漿細胞時，免疫組化染色可以有效顯示漿細胞，從而提高CE診斷的靈敏度和特異度。研究結果顯示，186例RIF病人中，77例CD38、CD138表達皆為陽性，診斷為CE，陽性率為41.40%。這與Johnston-MacAnanny等［10］、Yang等［17］團隊的研究結果相似，顯示CD138主要表達于漿細胞膜及細胞質，CD38表達于細胞膜，大約有1/3的RIF病人患有CE。但國外研究中多采用CD138單一指標行CE的診斷，容易造成假陽性的出現，聯合采用CD38，可提高診斷的特異度。

CD38、CD138免疫組化染色能夠很好地解決尋找漿細胞的問題，但在臨床工作中，取材受限也是造成漏診的重要原因。隨著微創器械技術的不斷發展，宮腔鏡已被廣泛應用于宮腔狀況評估，具有檢查時間短，創傷較小的優點，通過直觀觀察宮腔形態，明確病變部位，對可疑異常部位做出精確的活檢。子宮內膜炎引起的子宮內膜間質、血管、腺體等多方面的改變，可以通過宮腔鏡檢測，宮腔鏡下子宮內膜局灶或彌漫性充血、子宮內膜微小息肉（＜1 mm）、子宮內膜間質水腫等對于CE的診斷具有重要作用［8-9，18-19］，但國內對宮腔鏡下CE診斷的靈敏度及特異度性鮮有報道，其診斷CE臨床價值尚需進一步證實。本研究中，186例病人均行宮腔鏡檢查，112例宮腔鏡下診斷為CE，余下74例宮腔鏡下未見明顯異常，在CE/HS組病人中，73例組織學診斷為CE，陽性率為65.18%，74例非CE/HS組病人中，4例診斷為CE，陽性率為5.41%，宮腔鏡在診斷CE與免疫組化病理學診斷結果具有中度一致性，靈敏度為94.81%，特異度為64.22%，陽性預測值為65.18%，陰性預測值為94.60%。結果提示，宮腔鏡檢查在CE的診斷具有一定的臨床意義，其靈敏度較高，特異度稍低，陰性預測值較高，不易漏診，但是其特異度、陽性預測值低，無法取代組織病理學診斷方法。因其靈敏度較高，同時可以全面評估宮腔以及子宮內膜情況，對于RIF病人可行宮腔鏡檢查，評估子宮內膜情況，對于可疑CE的部位進行取材，聯合CD38、CD138進行免疫組化診斷CE，在臨床工作中對于CE的診斷具有重要意義。

綜上所述，宮腔鏡診斷CE具有較高的靈敏度及陰性預測值，因其特異度低，無法替代組織病理學診斷方法，聯合CD38、CD138免疫組化染色能顯著提高CE的檢出率，具有重要的臨床意義。