線性探針技術在耐藥結核病診斷中的應用

徐東芳，王超，包訓迪，王慶

作者單位：安徽省胸科醫(yī)院檢驗科，安徽 合肥230022

肺結核是一種嚴重威脅人類健康的疾病，是由結核分枝桿菌感染病人的肺部而引起的一種感染性疾?。?］。我國2007—2008年結核病耐藥基線調(diào)查結果顯示，肺結核病人耐多藥結核?。╩ultidrugresistant tuberculosis，MDR-TB）率為8.32%，廣泛耐多藥（extensively drug-resistant tuberculosis，XDRTB）率為0.68%，估計全國每年大約新發(fā)MDR-TB病人14萬例［2］。我國結核病實驗室診斷能力普遍低，臨床上傳統(tǒng)的結核分枝桿菌培養(yǎng)和藥敏試驗——BACTECTMMGIT 960快速液體法（以下簡稱為“MGIT 960法”）生物安全要求高，所耗時間長，限制其在臨床中的應用。近年來，隨著結核病耐藥分子機制研究逐步取得新進展，人們建立了多種檢測耐藥結核病耐藥基因的快速分子診斷技術。線性探針技術（line probe assay，LiPA）通過檢測結核分枝桿菌利福平耐藥基因ropB以及異煙肼耐藥基因katG和inhA常見突變，可于6～8 h內(nèi)完成耐藥結核病檢測［3］。本研究旨在以MGIT 960法為標準，用LiPA檢測479例臨床疑似結核病病人痰標本中結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosis complex，MTBC）及相關耐藥基因rpoB、katG及inhA的突變，評價LiPA檢測效能及推測MTBC對利福平和異煙肼的耐藥性，為耐藥結核病的早期診斷提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料據(jù)《肺結核診斷和治療指南》［4］，連續(xù)納入2018年9月至12月安徽省胸科醫(yī)院結核科收治的479例結核病疑似病人的痰標本。其中，男361例，女118例；年齡（48.07±12.52）歲，范圍為12～85歲。病人或其近親屬簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2方法

1.2.1 主要儀器和試劑 BACTECTMMGIT 960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定系統(tǒng)；分枝桿菌生長指示管（mycobacterial growth indicator tube，MGIT）；分枝桿菌培養(yǎng)添加劑（主要包括：油酸、白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶）；分枝桿菌藥敏試劑盒系列（異煙肼、利福平一線抗結核藥物）均為美國BD公司產(chǎn)品；MPT 64抗原（杭州創(chuàng)新生物技術有限公司）；GenoType MTBDRplus試劑盒（德國Hain Lifescience公司產(chǎn)品）。

1.2.2 方法 留取1～3 mL痰，4%氫氧化鈉消化前處理后，加入1 mL 0.067 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.8）混勻沉淀物，0.5 mL接種BD MIGT 960管（含0.8 mL營養(yǎng)添加劑），0.5 mL用于LiPA檢測，對所有入選痰標本同時進行MIGT 960培養(yǎng)和LiPA檢測。

1.2.2.1 MGIT 960法菌型鑒定和液體藥敏試驗陽性培養(yǎng)物均做初步菌型鑒定，滴加3～4滴（約120μL）于MTBC分泌蛋白64（Mycobacterium tuberculosis secreting protein，MPT64）反應板上進行快速鑒定，鑒定為MTBC的菌株，嚴格按照《結核病實驗室診斷技術培訓教程》［5］和BD MIGT 960說明書操作手冊將其加入含有利福平（1 mg/L）和異煙肼（0.1 mg/L）藥物的培養(yǎng)管中，進行利福平和異煙肼的耐藥性檢測。

1.2.2.2 LiPA檢測方法 留取的0.5 mL臨床痰標本前處理液于12 000 r/min離心5 min后棄上清，加入100μL無菌高純水中，充分混懸沉淀，95℃水浴20 min，超聲15 min后，5μL DNA提取液用于PCR過程，擴增30個循環(huán)，取20μL擴增產(chǎn)物經(jīng)過化學變性、雜交孵育、洗滌、耦聯(lián)和顯色后，根據(jù)試紙條上的探針顯色結果判定樣本中是否含有MTBC及其對利福平和異煙肼的耐藥性。

1.2.3 質(zhì)量控制 每次LiPA檢測均有陽性對照H37Rv和陰性對照（水）進行質(zhì)控。LiPA檢測在雙盲下操作，野生條帶缺失且突變條帶未出現(xiàn)突變、野生或質(zhì)控條帶極弱甚至缺失，影響結果判讀的用陽性培養(yǎng)物重新進行檢測。

1.3統(tǒng)計學方法本研究均為計數(shù)資料，使用SPSS 22.0軟件，采用配對χ2檢驗（McNemar檢驗）和Kappa一致性檢驗以驗證檢測結果的統(tǒng)計學差異與一致性。當Kappa≥0.75時，一致性較好；0.40≤Kappa＜0.75時，一致性一般；Kappa＜0.40時，一致性較差。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTBC檢測效能的比較分析以MGIT 960法為標準，LiPA檢出MTBC的靈敏度和特異度分別為96.82%（274/283），97.45%（191/196），兩者檢測的陽性率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。且經(jīng)Kappa一致性檢驗，Kappa＝0.940，P＜0.001，一致性較好。

表1 LiPA檢測479例結核病疑似病人的痰標本結果分析/例

2.2 LiPA檢測利福平和異煙肼藥物敏感性的效能分析LiPA和MGIT 960法兩種方法檢測MTBC均陽性的標本有274例，以MGIT 960法為標準，LiPA檢測利福平和異煙肼的靈敏度分別為95.18%（79/83）、81.61%（71/87），特異度分別為96.34%（184/191）、95.72%（179/187），兩者檢測的兩藥耐藥率均差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。且經(jīng)Kappa一致性檢驗，利福平、異煙肼耐藥Kappa＝0.906、0.793，均P＜0.001，一致性均較好。

2.3突變位點和基因突變類型LiPA檢測出的274株MTBC中，利福平耐藥86株，占31.387%（86/274），其中突變頻率最高的位點是S531L，占總耐藥的62.791%（54/86），其次是H526D，占15.116%（13/86），D516V占6.977%（6/86）。79株異煙肼耐藥株中，單獨katG基因突變占84.810%（67/79），inhA基因突變占7.595%（6/79），katG和inhA基因同時突變占7.595%（6/79），KatG基因常見突變位點是S315T，inhA基因常見突變位點是C15T。見表3。

表2 兩種方法進行耐利福平、異煙肼藥物敏感性檢測特異度和靈敏度分析/例

表3 線性探針技術（LiPA）檢測出的274株結核分枝桿菌復合群（MTBC）耐藥基因rpoB、katG和inhA突變譜的分布情況

3 討論

據(jù)WHO《2018年全球結核病報告》，2017年全球共有1 000萬例新發(fā)結核病例，其中耐藥結核病有56萬例，耐藥結核病中MDR-TB約占82%。加強結核病實驗室能力建設，提升MDR-TB的檢測能力能夠加大病人的發(fā)現(xiàn)力度，更為有效地實施MDRTB控制策略。LiPA主要檢測利福平和異煙肼的3個主要耐藥基因（rpoB、katG和inhA）。

本研究以MGIT 960培養(yǎng)法為標準，LiPA檢測MTBC有較高的靈敏度和特異度，分別為96.82%、97.45%，能為臨床疑似肺結核病人的快速分子診斷提供新的可靠的檢測方法，且將報告時間縮短至1 d，說明LiPA的檢測效能大大提高［6-7］。本研究發(fā)現(xiàn)有9例病例LiPA陰性而MGIT 960培養(yǎng)陽性，用其陽性培養(yǎng)物重新進行LiPA檢測，均能得出陽性結果。考慮可能原因是（1）LiPA檢測過程中，痰標本中存在Taq酶的抑制物抑制擴增反應；（2）痰標本前消化處理過程中氫氧化鈉消化過度引起MTBC損傷或丟失，造成DNA提取量不足，呈陰性結果，其陽性培養(yǎng)物含菌量高，DNA提取量充足，受抑制物影響小，可以得到理想的條帶結果。另外5例MGIT 960法培養(yǎng)陰性的病例而LiPA檢測是陽性，我們查其病歷發(fā)現(xiàn)他們均為進行抗結核治療有一段時間的結核病病人，可能痰標本中只有極少一部分死菌或者細胞壁已經(jīng)破壞的L型菌，故不能再在培養(yǎng)基上生長，但其結核分枝桿菌的DNA還沒能完全降解，因此雖然培養(yǎng)陰性，但是LiPA可以檢測出陽性結果。

LiPA可以高效檢測MTBC對利福平和異煙肼的耐藥性，本研究以MGIT 960法為標準，檢測MTBC對利福平耐藥靈敏度為95.18%（79/83），對異煙肼耐藥靈敏度為81.61%（71/87），造成對異煙肼耐藥靈敏度較低的可能原因是LiPA只能檢測其KatG和inhA基因，耐藥相關性只能達到70%～85%［8］，不能覆蓋異煙肼的全部耐藥基因，但是對其檢測的特異度均超過95%，因此LiPA檢測異煙肼耐藥性靶基因還需要進一步研究。LiPA檢測利福平耐藥中突變頻率最高的是S531L，占62.791%（54/86）、其次是H526D（15.116%）和D516V（6.977%）。在異煙肼耐藥株中，katG基因突變占84.810%，inhA基因突變7.595%（6/79），katG和inhA基因同時突變7.595%（6/79），KatG基因常見的突變是S315T，inhA基因常見突變位點是C15T。有的菌株單純基因突變（ropBM3，inhA-M1），也有的基因突變同時伴有野生型基因的丟失（ropB-WT8-M3，inhA-WT1-M1）導致耐藥，不同地區(qū)或者同一地區(qū)不同時間段的結核分枝桿菌耐藥株的基因突變類型和頻率可能會因為受調(diào)查人群數(shù)量的范圍而略有不同，這與國內(nèi)外的研究［9-10］基本相似。

綜上所述，以MGIT 960法為標準，LiPA診斷耐藥結核病具有靈敏度高、特異度強、快速準確的特點，為耐藥結核病的早期發(fā)現(xiàn)和治療提供了診斷依據(jù)。但LiPA操作技術和防污染措施要求非常嚴格，必須在國家驗收合格的分子生物學實驗室才能開展工作。