一測多評法同時測定保肝丸中4個指標性成分的含量

任瑩，呂曉軍，李德林，王虎

作者單位：太和縣中醫院制劑室，安徽 阜陽236600

保肝丸是太和縣中醫院國家級重點科室肝病科臨床應用多年的專用方，主要由黨參、白芍、大黃等中藥組成。保肝丸作為療效顯著且臨床應用多年的醫院傳統中藥制劑，亟須建立完善的質量控制及評價方法，為該制劑的物質基礎研究和臨床推廣應用奠定基礎。本研究于2018年6—12月以對照品便宜易得的黃芩苷為內標，建立保肝丸中主要藥味的指標性成分芍藥苷、五味子醇甲、大黃素含量的QAMS，以期為保肝丸的質量控制提供更全面可靠的依據，進而保證制劑質量，確保臨床療效。

1 儀器與試劑

UltiMate3000高效液相色譜儀［二極管陣列檢測器（DAD），賽默飛世爾科技有限公司］；Agilent1220型高效液相色譜儀（紫外檢測器，安捷倫科技有限公司）；XP205DR型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司），萬能粉碎機（上海賀帆儀器有限公司）。

對照品黃芩苷（110715-201720），芍藥苷（110736-201640），五味子醇甲（110857-201714），大黃素（110756-201512）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇，均為色譜純，美國天地公司；磷酸，分析純，天津北方天醫化學試劑廠；哇哈哈純凈水。

保肝丸為太和縣中醫院中藥制劑室生產，批號分別為 20170826、20171012、20171221、20180127、20180306、20180509。缺味陰性樣品均由中藥制劑室自制。

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別取芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為0.683 1、0.442 1、0.374 5、0.368 1 g/L的對照品儲備液。分別精密吸取芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素儲備液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容制成6個質量濃度不同的混合對照品溶液，分別編號1、2、3、4、5、6。

2.1.2 供試品溶液的制備 取保肝丸適量，粉碎，過四號篩，精密稱取約1 g，加甲醇25 mL，稱重，超聲處理30 min，放冷，稱重，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

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2.1.3 保肝丸缺白芍溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺白芍的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺白芍陰性供試液。

2.1.4 保肝丸缺黃芩溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺黃芩的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺黃芩陰性供試液。

2.1.5 保肝丸缺五味子溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺五味子的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺五味子陰性供試液。

2.1.6 保肝丸缺大黃溶液的制備 按保肝丸的制備工藝制得缺大黃的陰性樣品，按“2.1.2”項下的制備方法制備缺大黃陰性供試液。

2.2色譜條件UltiMate3000高效液相色譜儀，依利特Hypersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以乙腈和0.01%磷酸水溶液為流動相，梯度洗脫，梯度洗脫時間及比例見表1，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，分段變波長測定0～25 min，230 nm、＞25～50 min，280 nm，＞50～90 min，254 nm。

表1 UltiMate3000高效液相色譜儀梯度洗脫時間表

2.3方法學考察

2.3.1 專屬性考察 按“2.2”色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、各缺味陰性對照溶液，依次注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，結果顯示，各陰性對照均無干擾（圖1），說明該方法專屬性較好。

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下系列混合對照品溶液各5μL，注入高效液相色譜儀。以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得各成分的回歸方程、相關系數，具體見表2。

表2 混合對照品溶液4種成分線性關系考察結果

2.3.3 精密度試驗 取保肝丸樣品（批號20180127），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，記錄芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的峰面積，計算各成分峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.34%、0.62%、0.21%、0.22%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 取保肝丸樣品（批號20180127），按照“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，分別進樣，記錄各色譜峰的峰面積。計算結果顯示芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的平均含量分別為1.708、1.106、0.935、0.921 mg/g，RSD分別為1.02%、0.87%、1.16%、0.68%，表明該方法的重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取保肝丸樣品（批號20180127），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于樣品制備后0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄各色譜峰的峰面積。計算得芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素峰面積的RSD分別為0.65%、0.79%、1.04%、0.92%，表明供試品溶液在24 h內較為穩定。

2.3.6 加樣回收率試驗 取保肝丸樣品（批號20180127）6份，每份約0.5 g，精密稱定，加入一定量對照品溶液，使樣品中待測成分量與對照品加入量大致相等，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣并記錄各色譜峰的峰面積。計算得芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的平均加樣回收率分別為98.65%、101.23%、99.32%、97.58%，RSD分別為1.26%、1.04%、1.35%、1.13%。表明該方法準確度較高。

2.4相對校正因子的確定

2.4.1 相對校正因子的測定 本實驗采用多點校正法［1］，取“2.1.1”項下制備的系列混合對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件分別進樣5μL，記錄各對照品色譜峰面積，按照公式fk/m＝fk/fm＝（Wk×Am）/（Wm×Ak）（式中Ak為內參物的峰面積，Wk為內參物的質量或濃度；Am為待測物的峰面積，Am為待測物的質量或濃度），以黃芩苷為內參物，分別計算芍藥苷、五味子醇甲、大黃素的相對校正因子［9］，結果見表3。

表3 指標性成分的相對校正因子

2.4.2 不同儀器和色譜柱對校正因子的影響 分別采用賽默飛UltiMate3000、Agilent1220型高效液相色譜儀；依次利用依利特Hypersil ODS2、Thermo Syncrois C18、Agilent ZORBAX SB C18色譜柱，取系列對照品進樣檢測，按照“2.4.1”項下公式，計算各成分的相對校正因子，考察不同色譜儀器和色譜柱對各待測成分的相對校正因子的影響，結果見表4，5。結果表明不同儀器和不同色譜柱對各成分的相對校正因子無明顯影響。

表4 不同儀器對相對校正因子的影響

表5 不同色譜柱對相對校正因子的影響

2.5樣品測定及準確性驗證分別采用外標法和一測多評法（QAMS）測定6批保肝丸中4種指標性成分芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素的含量，并將兩種方法的計算結果進行比較，結果表明外標法和本實驗建立的一測多評法所得結果無明顯差異，各待測成分的相對校正因子可靠，該一測多評法準確度較高。見表6。

3 討論

中藥具有多成分、多靶點的作用特點，中藥的多種活性成分是其發揮療效的物質基礎，因此多成分的質控模式已成為中藥質量控制的重點［10-12］。本實驗測定的4種成分芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素是處方中主要指標性成分。研究表明黃芩苷能改善炎癥及肝細胞凋亡，減輕肝細胞損傷程度，且效果與黃芩苷用量相關［13］，另有動物實驗表明黃芩苷對肝纖維化的發生和發展具有抑制作用［14］；芍藥苷能抑制肝損傷中炎性因子的產生，提高肝組織中膽鹽輸出泵（BSEP）和多藥耐藥蛋白（MRP2）的表達［15-16］；五味子醇甲能抗氧化、對肝損傷具有保護作用［17］；大黃素能降低肝細胞炎癥反應，減少肝細胞凋亡，進而減輕肝細胞損傷程度［18］，對膽汁淤積引起的肝損傷具有保護作用［19］。

本實驗測定的4種指標性成分，化學結構差異較大，為能夠同時分離檢測4種成分，對各實驗條件及參數進行了反復摸索。首先采用單因素變量法考察了提取條件，包括提取溶劑、提取方式、提取時間，優選出25倍甲醇超聲處理30 min。其次，流動相方面選擇洗脫能力較強的乙腈和0.1%磷酸水溶液，各個目標峰均能達到較好的分離度且峰型較好。最后檢測波長考察，根據4種成分的紫外全波長掃描結果，選擇分段檢測，即230 nm檢測芍藥苷，280 nm檢測黃芩苷，254 nm檢測五味子醇甲和大黃素。

該實驗利用梯度洗脫的方法使4種成分均能達到較高的分離度，并通過專屬性實驗證明各成分的含量測定均無干擾；選擇DAD檢測器進行分波段檢測，雖然化學結構差異較大，各成分仍能有較高的信號相應，精密度較高；同時線性關系考察結果顯示在一定范圍內各成分的峰面積與進樣量呈良好線性關系；加樣回收實驗的結果顯示含量測定的準確度較高。以上試驗作為該方法的前期方法學考察，顯示了該方法在分離檢測上的準確性和可靠性，為下一步的數學模式分析奠定基礎。QAMS是以一種組分為內參，通過建立其與其他待測成分的相對校正因子，實現以一種對照品同時測定多個指標成分的目的。故相對校正因子是影響QAMS的準確度的決定性因素，而實際運用中，待測組分的濃度及色譜系統因素均會對相對校正因子產生影響。實驗在充分考慮濃度因素的情況下，運用多點校正法［1］計算相對校正因子；并進一步重點考察了不同色譜儀、不同色譜柱的相對校正因子，結果顯示RSD均小于2%，表明該方法的系統適應性較好。最后，通過比較外標法和QAMS的測定結果，兩種方法無明顯差異，說明各待測成分的相對校正因子可靠，該QAMS準確度較高。

表64 種指標性成分外標法和一測多評法（QAMS）定量測定結果/（mg/g）

綜上，本實驗建立了以黃芩苷為對照品，同時測定保肝丸中芍藥苷、黃芩苷、五味子醇甲、大黃素4種指標性成分的方法，與常規的一測一評法比較大大降低了質控的成本，縮短了檢測周期，經驗證該方法專屬性強、重復性好，準確度高，為保肝丸的全面質量控制提供了更為便捷經濟的途徑。