Sysmex HISCL-5000全自動血凝儀檢測TAT、TM、PIC、tPAIC項目的性能驗證

李 雯，張 磊,雷 娜，張 雯，魏 偉，徐 陽

西安交通大學第二附屬醫院檢驗科，陜西西安 710004

凝血酶-抗凝血酶復合物(TAT)、纖溶酶-α2纖溶酶抑制物復合物(PIC)、血栓調節蛋白(TM)、組織纖溶酶原激活物/纖溶酶原激活物抑制劑-1復合物(tPAIC)是目前新型的止血與血栓系統早期標志物。TAT是凝血酶與其主要抑制劑抗凝血酶按1∶1比例結合形成的復合物，可用于評估體內凝血系統的激活情況。TM是主要存在于血管內皮細胞上的高親和性凝血酶受體，通過與凝血酶結合，形成凝血酶-TM復合物，進而活化蛋白C，發揮抗凝作用。t-PAIC是血管內皮細胞釋放到血液中的組織纖溶酶原激活物t-PA與其生理性抑制因子纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)1∶1結合形成的復合物。PIC是活化的纖溶酶與α2-抗纖溶酶抑制物1∶1結合形成的復合物[1]。因此，TAT和TM是凝血系統標志物。t-PAIC和 PIC是纖溶系統標志物。t-PAIC和TM是血管內皮系統標志物。檢測TAT、TM、PIC、tPAIC對于血栓性疾病、心肌梗死、腦血管疾病、彌散性血管內凝血的早期診斷、溶栓治療、外科手術以及抗凝藥物的監測都具有指導意義。 本次試驗根據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)系列指南文件對使用Sysmex HISCL-5000全自動凝血儀及配套試劑對TAT、TM、PIC、tPAIC檢測的性能進行了驗證，內容包括批內精密度、日間精密度、線性、檢出限、攜帶污染率、參考值范圍驗證?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 選擇健康體檢者，參照 CLSI H21-A5文件處理血漿[2]，用0.109 mmol /L 檸檬酸鈉抗凝管采集患者的靜脈血1.8 mL，1 500×g離心10 min，分離出乏血小板血漿，要求標本無溶血、凝固、乳糜現象，紅細胞比容<55%。

1.2儀器與試劑 全自動血凝儀(型號：Sysmex HISCL-5000)及配套試劑。

1.3驗證方法

1.3.2線性驗證 參照EP6-A[4]文件，選取2個高濃度水平的混合血漿，分別使用HISCL標本稀釋液稀釋5個階段，每個稀釋后的標本測定3次取均值作為一個點，將5對實測值與理論值作直線回歸，得到回歸方程Y=aX+b和相關系數r2驗證線性范圍。回歸方程斜率在1±0.05 范圍內，相關系數r2≥0.95判定為合格。

1.3.3檢出限驗證 參照EP17-A[5]文件中的要求，空白檢出限(LOB)：選稀釋液作為空白樣品連續測定10次；樣本檢出限(LOD)選擇取枸椽酸鈉抗凝樣本，取出血漿與HISCL Wash配制濃度分別為100%、80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%、0的11個系列樣本，每一樣本連續測定10次；分別計算每一樣本的均值、標準差、變異系數、百分偏差，然后得出LOB、LOD。

1.3.4參考區間驗證 參考C28-A2文件[6]，隨機收取20例健康體檢者血漿，排除影響血凝檢測結果的因素(如服用抗凝藥物，避孕藥等干擾因素的人群)，測定標本并計算R值(R= 結果落在參考范圍內的樣本數/總的實驗樣本數)，要求 R≥0.9，即為驗證通過。

1.3.5攜帶污染率驗證 參照CLSIH57-A文件[7],高值樣本污染：將低值樣本(N)置1和3 位置，高值樣本(A)置于2位置，每個樣本測3次，記錄結果：N1、N2、N3、A1、A2、A3、N4、N5、N6。按照公式，攜帶污染率=[N4-均值]/均值，均值指N1、N2、N3平均值。尚未查到對TAT、TM、PIC、tPAIC檢測攜帶污染率有要求的指南性文件，僅有相關血凝儀性能驗證文獻[8-9]報道各項目CV<10%。

1.4統計學處理 采用 Excel2003進行數據統計分析。

2 結 果

2.1精密度驗證結果 廠家試劑盒說明書要求：要求TAT、TM、PIC、tPAIC批內不精密度和日間不精密度的CV<15%，驗證結果符合要求,見表1。

2.2線性驗證結果 TAT線性驗證試驗理論值和實測值的回歸方程為Y=0.994 7X+0.291 6，r2=0.999 9,TM線性驗證試驗理論值和實測值的回歸方程為Y=0.999 1X-0.145 8，r2=0.999 7；PIC線性驗證試驗理論值和實測值的回歸方程為Y=1.028 5X-0.053 1,r2=0.996 8；tPAIC線性驗證試驗理論值和實測值的回歸方程為Y=1.024 2X+0.323 3,r2=0.995 9，均符合線性回歸方程的斜率在1±0.05范圍內及r2≥0.95的要求，驗證結果表明TAT、TM、PIC、tPAIC實測值和理論值之間線性關系良好。

2.3檢出限驗證結果 TAT最低檢出限0.006 8 ng/mL，TM最低檢出限0.067 1 TU/mL，PIC最低檢出限0.001 2 μg/mL，tPAIC最低檢出限0.026 5 ng/mL。均小于廠家說明書給出的最低檢出限。

表1 精密度驗證結果

2.4參考區間驗證結果 20例健康人TAT、TM、PIC、tPAIC檢測結果100%在廠家說明書提供的參考范圍內(TAT參考范圍<4.0 ng/mL，TM參考范圍3.8～13.3 TU/mL，PIC參考范圍<0.8 μg/mL，tPAIC男性<17 ng/mL，tPAIC女性<10.5 ng/mL)，符合廠家要求，驗證通過，見表2。

2.5攜帶污染試驗結果 TAT高值對低值的污染所引起的相對偏差為 0.75%；TM高值對低值的污染所引起的相對偏差為-0.64%；PIC高值對低值的污染所引起的相對偏差為1.15%，tPAIC高值對低值的污染所引起的相對偏差為1.22%。攜帶污染率可接受，見表3。

表2 參考值驗證

表3 高值樣本對低值樣本的攜帶污染率(%)

3 討 論

作為新型止血血栓系統標志物，TAT、TM、PIC、tPAIC涵蓋了止血與血栓系統中的三大方面。TAT是凝血酶生成標志物，正常血漿中半衰期較短，一旦TAT持續呈現出高值，則意味著血液中有凝血酶生成，提示血栓形成傾向，可以作為血栓前狀態的早期標志物。TM穩定表達分布在膜表面和血漿中，當人體正常的內皮細胞發生病變或受損時，常引起TM的表達分泌異常，因此TM被視為內皮細胞損傷的標志物。而PIC是反映體內纖溶系統激活的標志物，預示血栓正在形成。tPAIC是最重要的纖溶和凝血系統平衡的調節者，提示血栓進行時，導致血栓原發病因未去除。因此，在凝血紊亂引起血栓性疾病甚至DIC時，新型標志物的聯合檢測具有極其重要的價值。血栓性疾病是一種起病隱匿，發病突然致死致殘率較高的疾病，目前我國血栓性疾病發病率高達1‰，病死率可達5% ～ 10%[10]。造成血栓性疾病的高漏診率和高誤診率的原因如下，一是大多數靜脈血栓沒有癥狀，二是缺乏早期的實驗室指標。新型標志物的出現彌補了血栓性疾病早期實驗室診斷的空白。一項應用凝血標志物診斷創傷骨科術后靜脈血栓形成的病例對照研究表明，TAT、TM、PIC、tPAIC檢測有助于早期預測創傷創傷骨科術后靜脈血栓形成，且優于D-二聚體[11]。也有文獻報道PIC和與tPAIC許多心血管疾病密切相關[12]，PIC和與tPAIC是心血管疾病相關標志物之一。同時對于危重癥凝血紊亂合并彌散性血管內凝血DIC患者，新型標志物可以更早的提示前DIC狀態。有研究表明，在前DIC期，TAT，PIC等在前DIC發生顯著變化[13]。目前，日本已經將TAT的增加添加進了DIC診斷標準中作為輔助檢查的項目，國際血栓止血學會、標準化委員會(ISTH/SSC)的診斷標準(2001年)中也將其作為“non-overt DIC”的特異性診斷項目進行了評分[14]。

不僅對于血栓性疾病的診斷，在血栓性疾病的治療與監測方面，新型標志物也有極為重要的意義。有文獻報道急性心肌梗死冠狀動脈內t-PA溶栓同時行肝素抗凝的患者，溶栓后120 min血漿TAT水平大于6 ng/L可預測溶栓失敗和血栓再閉塞；血漿TAT小于6 μg/L時,對鑒別血管持續開通和未成功溶栓治療的靈敏度和特異度度分別為92.5%和93.3%,故TAT也可作為觀察溶栓治療療效的指標[15]。

因此，本院引進Sysmex HISCL-5000開展TAT、TM、PIC、tPAIC新型標志物檢測，能更好地輔助臨床對于血栓性疾病、心肌梗死、腦血管疾病、DIC的早期診斷，以及對外科手術、抗凝藥物、溶栓治療的監測。Sysmex HISCL-5000是目前世界上唯一使用高敏化學發光檢測凝血項目的儀器。與傳統ELISA方法耗時長，干擾因素多，批間差異大相比，Sysmex HISCL-5000以化學發光酶免疫測定法為原理，采用堿性磷酸酶作為催化劑，以顯示出很強發光強度CDP-Star作為化學發光基質，具有靈敏度，可到達10～21 mol/L，檢測速度快，特異度高的特點。為了驗證廠家對Sysmex HISCL-5000所宣稱的性能，本次試驗參考CLSI系列指南文件對使用Sysmex HISCL全自動凝血儀及配套試劑對TAT、TM、PIC、tPAIC檢測項目的性能進行了驗證。實驗室如果使用的檢測系統是封閉系統，則只需做包括：精密度、線性實驗、參考區間、檢測限、攜帶污染率等基本的參數。 精密度是指規定條件下所獲得獨立測量結果的接近程度，體現檢測系統的重復性，精密度分為批內精密度和日間精密度，是性能驗證的基礎。在線性評價驗證中，采用了二元一次直線回歸作為分析線性的EP6-A[4]評價方法，保證了結果的準確性和代表性。檢測限是分析測試的重要指標，指某一分析方法在給定的可靠程度內可以從樣品中檢測待測物質的最小量，確定檢測限時，儀器的空白值是重要依據。檢測限體現了儀器靈敏度，可以更好地了解儀器的測量范圍。參考區間的驗證中，在體檢服務的健康人群總體中抽出20個參考個體，驗證了小樣本參考值和說明書參考值之間的可比性。攜帶污染率是確定高濃度樣本對低濃度樣本的影響。通過本次實驗數據分析，Sysmex HISCL-5000全自動凝血儀及配套試劑對TAT、TM、PIC、tPAIC項目檢測的性能符合儀器廠家所宣稱的性能指標，能夠為臨床提供準確的檢測報告。

目前對于TAT、TM、PIC、tPAIC的性能驗證鮮見發表，對于血栓新型標志物，希望各級實驗室能夠參考指南規范化開展，從而保證檢驗結果準確、可靠，更好地為臨床提供參考。