聯(lián)合檢測miR-518b、miR-15b和ACR對妊娠期高血壓疾病腎功能損傷的診斷價值

李 虹

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200137

妊娠期高血壓疾病(HDP)是妊娠期間發(fā)生的高血壓，臨床水腫和蛋白尿等是其臨床表現(xiàn)，病情較重的患者可出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥，尤其是腎臟的損傷。目前診斷腎功能損傷的主要指標是尿清蛋白和血肌酐，而早期腎功能損傷者往往血肌酐和尿素氮水平均在正常范圍，尿蛋白常常為陰性。因此，尋找更為靈敏的腎損傷指標成為目前研究的熱點。有研究表明，微小RNA(miRNA)參與了HDP的發(fā)生、發(fā)展過程，并且miR-518b和miR-15b參與了子癇前期的發(fā)生、發(fā)展過程，是子癇前期嚴重程度的預(yù)測指標[1]，但其是否能夠用于診斷腎功能損傷鮮見報道。本研究對HDP患者血清miR-518b和miR-15b水平檢測在診斷腎功能損傷中的價值進行了探討。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年12月在本院就診的HDP患者108例作為HDP組，均符合HDP的診斷標準；根據(jù)病情的嚴重程度分為妊娠期高血壓組(50例)、輕度子癇前期組(38例)和重度子癇前期組(20例)。根據(jù)KDIGO的標準[2]，采用CT對腎臟功能是否損傷進行診斷，將HDP患者分為腎功能損傷組(內(nèi)生肌酐清除率<80 mL/min，21例)和腎功能正常組(87例)；腎功能正常組年齡21～40歲、平均(28.34±6.82)歲，孕周21～37周、平均(30.75±3.85)周，體質(zhì)量57.65～79.8 kg、平均(69.56±4.65)kg；腎功能損傷組年齡22～38歲、平均(28.83±7.19)歲，孕周22～38周、平均(31.09±3.18)周，體質(zhì)量57.16～79.18 kg、平均 (69.82±5.19) kg。選擇同期于本院行妊娠體檢的健康孕婦75例作為正常妊娠組，年齡20～38歲、平均(28.67±7.28)歲，孕周21～37周、平均(30.48±3.62)周，體質(zhì)量58.64～78.61 kg 、(68.92±5.16) kg。選擇同期在本院行體檢的健康婦女45例作為健康對照組，年齡21～39歲、平均(28.19±8.16)歲，體質(zhì)量58.64～78.19 kg、平均( 68.49±4.86)歲。納入標準：妊娠婦女均為單胎和頭位妊娠。排除標準：妊娠前有高血壓和糖尿病者；妊娠前有腎臟疾病如腎小球腎炎、腎病綜合征者；有惡性腫瘤者；有肝炎、結(jié)核和肺部感染等急、慢性感染者；有妊娠期其他合并癥者。各組年齡和體質(zhì)量等基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入研究者均知情同意，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1標本的采集 納入研究者入院后抽取肘靜脈血10 mL，留取小便中段尿液10 mL。血液標本以3 000 r/min離心15 min，抽取上清液放置在除酶管內(nèi)，于-70 ℃冰箱保存。尿蛋白和尿肌酐采用西門子ADVIA 2400型全自動生化儀檢測(免疫比濁法)，使用配套試劑盒。

1.2.2實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR) 總RNA提取：取受試者血清400 μL，采用TaqMan miRNA試劑盒提取血清總RNA，反轉(zhuǎn)錄引物由上海化生有限公司合成。miR-518b引物序列，上游：5′-CAA AGC GCT CCC C-3′，下游：5′-GAG CAG GCT GGA GAA-3′；miR-15b引物序列，上游：5′-ACA CTC CAG CTG GGT TAG CAG CAC ATC AT-3′，下游：5′-CAC AGC TCG TAG AAC AGG AGG-3′。U6引物序列，上游：5′-TGC GGG TGC TCG CTT CGG CAG CA-3′，下游：5′-CCA CTG CAG GGT CCG AGG T-3′。取反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、RNA 5 μL、引物3 μL，采用美國ABI 公司TaqMan PreAmp Master Mix試劑盒進行擴增，20 μL反應(yīng)體系，在熒光定量儀中進行，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性為15 min，94 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，連續(xù)40個循環(huán)。每個樣品檢測3次，以2-ΔΔCt計算相對表達水平。

1.2.3觀察指標 觀察各組血清miR-518b、miR-15b水平和隨機尿清蛋白與尿肌酐比值(ACR)水平；分析血清miR-518b、miR-15b和ACR水平與HDP患者嚴重程度和腎損傷的關(guān)系，分析這3個指標用于HDP腎功能損傷診斷的效能及各指標之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1各組間血清miR-518b、miR-15b和ACR水平的比較 HDP組血清miR-518b和ACR水平均高于正常妊娠組和健康對照組(P<0.01)，正常妊娠組血清miR-518b水平高于健康對照組(P<0.01)。HDP患者血清miR-15b水平低于正常妊娠組和健康對照組(P<0.01)，正常妊娠組低于健康對照組(P<0.01)。見表1。

表1 各組間血清miR-518b、miR-15b和ACR水平的比較

2.2各組間血清miR-518b、miR-15b和ACR水平與妊娠高血壓嚴重程度的關(guān)系 重度子癇前期組血清miR-518b和ACR水平高于輕度子癇前期組和妊娠期高血壓組(P<0.01)，輕度子癇前期組高于妊娠期高血壓組(P<0.01)；重度子癇前期組血清miR-15b水平低于輕度子癇前期組和妊娠期高血壓組(P<0.01)，而輕度子癇前期組低于妊娠期高血壓組(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清miR-518b、miR-15b和ACR水平與妊娠高血壓嚴重程度的關(guān)系

2.3血清miR-518b、miR-15b和ACR之間的相關(guān)性分析 血清miR-518b、ACR水平與血清miR-15b水平均呈負相關(guān)(r=-0.652、-0.715，均P<0.05)，而血清miR-518b和ACR水平呈正相關(guān)(r=0.812，P<0.05)。

2.4血清miR-518b、miR-15b和ACR與妊娠高血壓腎功能損傷的關(guān)系 腎功能損傷組血清miR-518b和ACR水平高于腎功能正常組(P<0.01)，而血清miR-15b水平低于腎功能正常組(P<0.01)，見表3。

2.5血清miR-518b、miR-15b和ACR水平對HDP合并腎功能損傷的診斷價值 miR-518b、miR-15b和ACR 3個指標的二元Logistic回歸方程為Y=0.877XmiR-518b-2.698XmiR-15b+0.031XACR-7.518，miR-518b、miR-15b、ACR聯(lián)合檢測的靈敏度為90.5%，特異度為85.1%，曲線下面積(AUC)為0.940，明顯高于miR-518b、miR-15b和ACR(Z=1.972、2.624、2.652，均P<0.05)，而miR-518b、miR-15b和ACR間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表4。

表3 血清miR-518b、miR-15b和ACR與妊娠期高血壓腎功能損傷的關(guān)系

圖1 miR-518b、miR-15b和ACR用于HDP診斷的ROC曲線

表4 miR-518b、miR-15b和ACR對HDP腎功能損傷的診斷效能

3 討 論

HDP是產(chǎn)科常見的妊娠并發(fā)癥，發(fā)生率高達10%，與妊娠期心臟病和產(chǎn)后出血同為造成產(chǎn)婦死亡的重要原因。其主要的病理、生理變化是血管內(nèi)皮細胞受損，血管系統(tǒng)發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致患者全身毛細血管痙攣[2]。而腎臟對這些變化最為敏感，表現(xiàn)為基底膜受損和腎小球通透性增加，故HDP早期會出現(xiàn)腎臟微循環(huán)障礙和功能損傷。ACR是尿清蛋白和肌酐的比值，其中尿清蛋白常用于早期腎功能損傷的診斷[3]。有研究顯示，約有10%腎功能損傷患者尿清蛋白水平未出現(xiàn)異常，在未接受治療的情況下，腎功能損傷的患者尿清蛋白水平可在正常范圍，故通過單獨檢測尿清蛋白對腎功能損傷進行診斷具有一定的局限性[4]。ACR能校正尿清蛋白水平的波動，能更為準確地反映腎功能的損傷情況。本研究表明，HDP組尿ACR水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組，并且隨著HDP嚴重程度的升高而升高，說明ACR水平能夠反映HDP疾病的嚴重程度。腎功能損傷組尿液ACR水平高于腎功能正常組，與ACR能夠反映HDP患者腎功能損傷的報道一致[4]；ACR對腎功能損傷的診斷效能較高，當診斷界值為146.30時，靈敏度為71.4%，特異度為81.6%，AUC為0.802。

miR-518b位于19號染色體，主要在生殖細胞和胎盤組織中表達，主要由胎盤絨毛滋養(yǎng)細胞分泌，與胎盤的發(fā)育具有密切關(guān)系，是反映妊娠狀態(tài)的指標[5]。本研究顯示，HDP組患者血清miR-518b水平明顯高于正常妊娠組和健康對照組，并且隨著HDP嚴重程度升高而升高，說明miR-518b參與了HDP的發(fā)生、發(fā)展過程。有文獻報道，胚胎中miR-518b水平與疾病的嚴重程度相關(guān)，miR-518b可能與子癇前期的發(fā)病具有密切關(guān)系[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，腎功能損傷組患者血清miR-518b水平明顯高于腎功能正常組，并且發(fā)現(xiàn)當以4.94作為診斷臨界值時，其用于診斷HDP腎功能損傷的靈敏度為76.2%，特異度為78.2%，AUC為0.836，說明血清miR-518b水平對HDP腎損傷具有較高的診斷效能，與現(xiàn)有的報道一致[1]。在一項miRNA微陣列芯片的研究中，發(fā)現(xiàn)34個miRNA基因出現(xiàn)異常，11個高表達，23個低表達，其中miR-518b在重度子癇前期的胎盤中呈高表達[8]，在另一項研究中證實miR-518b是發(fā)生妊娠期高血壓的危險因素，在胎盤和外周血中水平均明顯增高[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDP組患者血清miR-15b水平低于正常妊娠組和健康對照組，并且隨著HDP嚴重程度升高而降低，說明miR-15b是HDP的保護因子，與HDP的發(fā)生、發(fā)展具有相關(guān)性。miR-15b家族成員位于染色體3q25.33區(qū)域，主要功能是調(diào)控血管內(nèi)皮細胞，通過對血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2結(jié)合降低血管內(nèi)皮細胞受體2的表達水平，從而減弱血管內(nèi)皮細胞形成血管的能力，達到對血管的生成具有明顯拮抗作用[10-11]。在子癇前期和流產(chǎn)的胎盤組織中，miR-15b的表達出現(xiàn)明顯降低，miR-15b在滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)皮細胞中具有重要的調(diào)控作用[1,12]。當血清miR-15b的診斷界值為1.05時，血清miR-15b對HDP患者發(fā)生腎功能損傷診斷的靈敏度為100.0%，特異度為64.4%，AUC為0.829，診斷效能較高。HDP患者血清miR-518b和ACR水平與血清miR-15b水平呈負相關(guān)，而血清miR-518b和ACR水平呈正相關(guān)，說明三者間在HDP的發(fā)病過程中具有某種內(nèi)在聯(lián)系，其具體內(nèi)在機制仍需進一步研究。miR-518b、miR-15b和ACR聯(lián)合檢測能夠提高對HDP腎功能損傷的診斷效能，聯(lián)合檢測的靈敏度為90.5%，特異度為85.1%，AUC為0.940，明顯高于各個指標單獨檢測，說明3個指標在檢測HDP腎功能損傷方面具有一定的互補性，可以提高診斷效能，但其確切的內(nèi)在機制需要進一步研究。

總之，血清miR-518b、miR-15b和ACR水平是HDP腎功能損傷的敏感指標，3個指標的聯(lián)合檢測能夠提高對HDP患者腎功能損傷的診斷效能。