福建省龍巖市333份分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果回顧性分析

黃文濱,張滿娥,盧志華,鄧文華,張洪彬

福建省龍巖市第二醫(yī)院分子生物實驗室，福建龍巖 364000

分枝桿菌主要分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB)、非結(jié)核分枝桿菌(NTM)、麻風(fēng)分枝桿菌三大類，其中麻風(fēng)分枝桿菌在臨床中較為少見。據(jù)全國第5次流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告結(jié)果顯示，我國是世界上排名第二的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，結(jié)核病的診療及預(yù)防形勢依然嚴(yán)峻[1]。臨床資料顯示，NTM病的臨床癥狀與結(jié)核病高度相似，且NTM對臨床一線抗結(jié)核藥物的耐藥率可高達(dá)100%[2]。有學(xué)者研究認(rèn)為，臨床上約有62%抗結(jié)核療效不佳的肺結(jié)核為NTM感染[3]，故區(qū)分MTB與NTM顯得尤為重要。北京博奧生物集團(tuán)有限公司的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒采用基因芯片技術(shù)，可較為精確地區(qū)分MTB和NTM，并可鑒別多種NTM，是目前較為可靠的分子層面分枝桿菌鑒定技術(shù)[4]。本文回顧性分析2016年5月至2019年12月來本院就診的疑似結(jié)核病患者分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果，以期為臨床診療提供指導(dǎo)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年12月來本院就診的756例疑似結(jié)核病的門診或住院患者為研究對象，其中男536例、女220例，年齡12～93歲、中位年齡56歲。收集所有患者檢測標(biāo)本進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定，標(biāo)本類型包括痰液、肺泡灌洗液、纖維支氣管鏡刷物、胸腔積液、腹水、腦脊液、尿液、關(guān)節(jié)液、傷口分泌物、穿刺液、前列腺液等。

1.2儀器與試劑 檢驗儀器為杭州博日科技有限公司生產(chǎn)的Tc-s-B Gene Max 基因擴(kuò)增儀，北京博奧生物集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的核酸快速提取儀、芯片洗干儀、微陣列芯片掃描儀。分枝桿菌菌種鑒定診斷試劑盒由北京博奧生物集團(tuán)有限公司提供。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理 根據(jù)標(biāo)本類型不同，標(biāo)本前處理有所差別，其中痰液、肺泡灌洗液、纖維支氣管鏡刷物、胸腔積液及腹水等呼吸道標(biāo)本及黏稠度比較高的關(guān)節(jié)分泌物，用10%NaOH液化，10%NaOH添加量根據(jù)標(biāo)本的黏度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，放置室溫30 min或更長時間，直至標(biāo)本完全液化，取1.0 mL標(biāo)本于1.5 mL離心管中，12 000×g離心5 min,棄上清液，加1 mL生理鹽水，振蕩混勻備用。尿液標(biāo)本取1.0 mL標(biāo)本于1.5 mL離心管中，12 000×g離心5 min,棄上清液，加1 mL生理鹽水，振蕩混勻備用。核酸提取、PCR擴(kuò)增、雜交反應(yīng)、洗片與芯片掃描等操作過程嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。其余傷口分泌物及腦脊液等標(biāo)本無特殊前處理，直接進(jìn)行核酸提取。

1.3.2分枝桿菌鑒定 采用基因芯片技術(shù)檢測分枝桿菌。針對臨床常見的分枝桿菌設(shè)計特異性的 PCR 擴(kuò)增引物及種屬特異性寡核苷酸探針。以臨床樣品中分離的致病菌 DNA 為模板，運用獨特的不對稱 PCR 技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。由于引物末端標(biāo)記有熒光分子，因此，在擴(kuò)增過程中待檢測的 DNA分子被擴(kuò)增為帶有熒光分子的 DNA 片段。 將標(biāo)記有熒光分子的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的探針在一定的條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則，序列匹配的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與探針形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。根據(jù)探針在芯片上的特定位置排布，就可以推斷出相應(yīng)被測細(xì)菌的相關(guān)信息，鑒定出被測細(xì)菌的種類。鑒定的細(xì)菌種類為臨床常見分枝桿菌的17個種或群，包括MTB、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、偶然分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、土分枝桿菌、龜或膿腫分枝桿菌、草分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、海/潰瘍分枝桿菌、金色分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌和瑪爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、恥垢分枝桿菌。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MTB、NTM分布情況 756份標(biāo)本中分枝桿菌陽性333份(44.05%)，其中MTB 290份(87.09%)，NTM 43份(12.91%)。MTB陽性標(biāo)本中男性檢出237份，女性檢出53份，男性檢出率明顯高于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.72，P<0.05)。而NTM男性檢出19份，女性檢出24份，女性檢出率略高于男性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.58，P>0.05)。見表1。

表1 756份標(biāo)本中MTB、NTM分布情況(n)

2.2各類型標(biāo)本MTB及NTM分離情況 290份MTB中，痰液分離205份，占70.69%；肺泡灌洗液分離73份，占25.17%；胸腔積液分離3份，創(chuàng)口分泌物分離2份，關(guān)節(jié)液、穿刺液、前列腺液、尿液各分離1份；另有3份標(biāo)本類型未明。43份分離出NTM的標(biāo)本中，痰液分離28份，占65.12%；肺泡灌洗液分離10份，占23.26%；創(chuàng)口分泌物分離2份；另有3份標(biāo)本類型未明。

2.3MTB及NTM感染者性別及年齡分布情況 MTB感染主要集中于20～80歲，>50～60歲感染者最多，10～20歲及>80歲感染者比例較小，除>20～30歲男女性別比例為1∶1外，其他各個年齡段男性患者比例均明顯高于女性患者比例。女性NTM感染者略多于男性NTM感染者，女性和男性比例為1.26∶1，其中10～20歲及>80歲感染者未見，感染者主要集中于>40～80歲，其中>70～80歲感染得最多。見表2。

2.443份NTM菌種分布情況 見表3。

表2 MTB及NTM感染者性別及年齡分布情況(n)

表3 43份NTM菌種分布情況

3 討 論

福建省龍巖市第二醫(yī)院為位于閩、粵、贛三省交界的龍巖市，作為龍巖市結(jié)核病定點醫(yī)院，本院為結(jié)核病專科醫(yī)療聯(lián)合體的牽頭單位，聯(lián)合各縣(市、區(qū))醫(yī)院負(fù)責(zé)龍巖市結(jié)核病的診療和預(yù)防工作，特別是疑難病例的診斷及治療。既往對龍巖市分枝桿菌菌種分布特征的研究報道較少[2，5]。本研究結(jié)果顯示，756份標(biāo)本中檢出分枝桿菌333份(44.05%)，其中MTB陽性290份(87.09%)，NTM陽性43份(12.91%)，MTB檢出率與徐州地區(qū)的84.6%相近，但低于四川、衢州、長沙、重慶等[6-9]地區(qū)，與全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告一致[1]；NTM陽性檢出率高于四川、長沙、重慶等地區(qū)，符合我國NTM感染沿海地區(qū)高于內(nèi)地地區(qū)的分布特征[6]。本研究中，龍巖市MTB檢出率低于2017年本市相關(guān)調(diào)查的95.9%，NTM檢出率則高于2017年的4.5%，表明龍巖市NTM感染有上升趨勢，且有相關(guān)報道研究顯示，龍巖市NTM患者對一線、二線抗結(jié)核藥均100%耐藥[2]，故疑似結(jié)核病患者治療前進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定尤為重要。本研究MTB標(biāo)本中男性檢出237份，女性檢出53份，男性檢出率明顯高于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明本市結(jié)核病患者以男性為主，與全球結(jié)核病患者的性別分布情況一致[10]，與中國全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告的結(jié)核病患者的性別分布也一致[1]。可能與男性不健康的生活方式(如飲酒、吸煙、熬夜、活動范圍大、交友廣泛)有關(guān)，尤其是吸煙會損害呼吸器官的屏障作用，進(jìn)一步降低肺功能，增加誘發(fā)結(jié)核病的可能性[11-12]。從各類型標(biāo)本MTB及NTM的分離情況可以看出，MTB(95.86%)及NTM(88.38%)大多數(shù)是從痰液及肺泡灌洗液中分離的，說明目前MTB及NTM感染主要是以呼吸道感染，即肺內(nèi)感染為主，肺外感染較少見。但需要特別注意的是，呼吸道標(biāo)本中分離出NTM，并不表示它一定致病，可能原因是呼吸道定植或者標(biāo)本存在污染所致，因此，臨床醫(yī)生需要謹(jǐn)慎分析。MTB感染者年齡主要集中在>50～60歲，以中老年為主，可能原因為中老年人的抵抗力較差所致。NTM感染者年齡主要集中在>40～80歲，年齡較重慶地區(qū)[13]明顯增高，與江蘇地區(qū)[14]一致。

檢出的43份NTM以胞內(nèi)分枝桿菌(25.58%)、鳥分枝桿菌(20.93%)、龜或膿腫分枝桿菌菌種(18.60%)為主，該結(jié)果與福建、湖南、重慶等地區(qū)[5，9，13]的臨床NTM菌種鑒定結(jié)果相同。與北京、四川、江蘇等地區(qū)[6-7，14-15]的臨床NTM菌種鑒定結(jié)果不同。與北京、江蘇等地區(qū)相比，龍巖市NTM菌種分布具有本地區(qū)的特點：北京堪薩斯分枝桿菌及偶然分枝桿菌分離率較高，而龍巖市較少見，僅為4.65%和2.33%。江蘇徐州地區(qū)NTM除胞內(nèi)分枝桿菌外，以堪薩斯分枝桿菌、淺黃分枝桿菌及戈登分枝桿菌為主，然而龍巖市淺黃分枝桿菌少見，戈登分枝桿菌未檢出。這些研究結(jié)果提示，NTM感染可能與地域環(huán)境及感染方式有關(guān)。本研究結(jié)果表明，中國NTM致病菌的種類分布存在明顯的地域差異性。本研究結(jié)果還顯示，女性NTM檢出率略高于男性，與江蘇、重慶等地區(qū)[8，13]報道的男性NTM感染率較高不同，與海南地區(qū)[16]報道的NTM感染者女性多于男性的報道一致，其原因可能與NTM感染在不同人群中有不同的機(jī)制和影響因素有關(guān)。本研究共檢出胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜或膿腫分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、海/潰瘍分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、偶然分枝桿菌、金色分枝桿菌共10種菌種。

有研究發(fā)現(xiàn)，大部分抗結(jié)核效果不佳的病例是由NTM引起的，其主要原因是由于NTM與MTB的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征及痰涂片等結(jié)果都極其類似，容易誤診、誤治[3]。而由不同菌種感染引起的疾病其治療方案是截然不同的，尤其是由不同的NTM 引起的 NTM病，化療方案的選擇和用藥時間都各不相同[17]。目前國內(nèi)大部分醫(yī)院并沒有開展NTM的藥敏試驗[5]，故在開始治療結(jié)核病前，進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定是非常有必要的。

本研究采用DNA微陣列芯片法鑒定分枝桿菌菌種，此方法與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，具有快速、準(zhǔn)確、標(biāo)本用量少等優(yōu)點，可以針對各種臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測，6 h即可鑒定出結(jié)果，對快速明確診斷、早期正確治療起到關(guān)鍵的作用，對臨床的早期診斷和治療具有重要意義。但此檢測方法也存在以下不足：首先，此檢測方法存在菌量濃度要求在1×103CFU/mL及以上的檢出限；其次，其僅能檢測臨床常見的17種分枝桿菌；再次，此檢測試劑盒僅能鑒定分枝桿菌菌種，不能對NTM進(jìn)行耐藥檢測。因此，在MTB及NTM防控中，應(yīng)加強(qiáng)實驗室能力建設(shè)，完善檢查項目，為臨床治療提供更合理的方案。

綜上所述，通過本次研究，基本了解和掌握了龍巖市分枝桿菌感染的菌種特征，可為龍巖市結(jié)核病的診斷、治療及防控策略的制訂提供參考依據(jù)。但本研究為回顧性分析，標(biāo)本量不大，僅為對一家醫(yī)院就診的疑似結(jié)核病患者的菌種鑒定結(jié)果分析，而并非基于人群的分析，MTB及NTM的檢出率可能存在偏倚。