GeneXpert MTB/RIF檢測肺泡灌洗液對無痰或少痰肺結(jié)核的診斷價值 *

彭 榮，龔 倩

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院檢驗科，上海 201700

結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病是全球造成死亡病例最多的單一傳染病[1]。肺結(jié)核的診斷一直依賴于痰標本檢測，但40%的疑似肺結(jié)核患者無痰或少痰[2]，這類患者往往容易被漏診。近年來，纖維支氣管鏡被廣泛應(yīng)用，其提供的細菌學(xué)和病理學(xué)診斷依據(jù)逐漸受到重視。多種檢查方法，如活檢、刷檢、支氣管肺泡灌洗液(BALF)涂片及培養(yǎng)等，聯(lián)合應(yīng)用可以提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率。結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測體系(GeneXpert MTB/RIF)是一套整合了核酸準備、擴增、實時檢測，用于結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥檢測的全自動化檢測技術(shù)，是WHO推薦的檢測結(jié)核分枝桿菌的新方法[3]；而對于很多無痰或少痰的患者，GeneXpert MTB/RIF無法對其痰液標本進行檢測，故本研究將此檢測技術(shù)用于無痰和少痰患者BALF標本的檢測，比較該技術(shù)與傳統(tǒng)BALF涂片法和培養(yǎng)法對肺結(jié)核的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取該院2017年10月至2018年10月無痰或少痰肺結(jié)核患者100例作為觀察組，無痰或少痰其他肺部疾病患者50例作為對照組。觀察組：男67例,女33例;年齡17～51歲,平均(28.4±15.7)歲。對照組：男24例，女26例；年齡19～56歲，平均(30.4±12.7)歲；肺部腫瘤23例，支氣管擴張27例；排除可能合并肺結(jié)核的患者。肺結(jié)核診斷參照《肺結(jié)核診斷標準》[4]。對照組肺部腫瘤、支氣管擴張等疾病的診斷參照文獻[5]。另外，無痰或少痰是指送檢的痰液標本性狀為水樣或者黏液樣并少于1 mL。

1.2儀器與試劑 纖維支氣管鏡為奧林巴斯BFP60型；GeneXpert MTB/RIF和配套試劑盒均為美國賽沛公司產(chǎn)品；BALF涂片法使用的染色液為珠海貝索公司產(chǎn)品；BALF培養(yǎng)法使用羅氏培養(yǎng)基，購自上海申啟生物科技公司。

1.3方法

1.3.1BALF標本的獲取 使用纖維支氣管鏡，選取納入研究者病變累及的肺段作為灌洗部位；使用一次性灌洗液回收裝置，將50 mL無菌生理鹽水分2次經(jīng)過纖維支氣管鏡注入病變累及的葉段支氣管，然后用負壓吸引緩慢回收，混勻后送檢。每份BALF標本約5 mL，平均分成2份，1份用于涂片法和培養(yǎng)法檢測；1份于-20 ℃凍存，用于GeneXpert MTB/RIF檢測。

1.3.2涂片法和培養(yǎng)法 涂片法：待測BALF以3 000×g離心15 min，取沉淀涂片；沉淀為濃厚的痰樣，涂片才容易固定；涂片自然干燥，紫外照射2 h，用抗酸染色液手工染色。培養(yǎng)法：在涂片完成之后的沉淀中加入等體積的4%氫氧化鈉，消化15 min后，取兩滴加入到羅氏培養(yǎng)基斜面。所有操作及后續(xù)涂片鏡檢和培養(yǎng)結(jié)果的判讀都嚴格按照《結(jié)核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]進行。

1.3.3GeneXpert MTB/RIF檢測 將之前凍存的BALF平衡至室溫，取1.5 mL BALF加入50 mL尖底離心管中，加入700 mL試劑盒自帶的標本處理液，靜置15 min,期間漩渦振蕩1～2次。將檢測盒打開，吸取2 mL處理后的樣品并緩慢加入到檢測盒中，上機檢測。機器設(shè)有A、B、C、D、E 5條相互重疊的分子探針，能夠與利福平rpoB基因的 81 bp 核心區(qū)結(jié)合并完全覆蓋。另外，此反應(yīng)體系中還包含1個球芽孢桿菌特異探針作為內(nèi)對照，當內(nèi)對照探針的循環(huán)閾值(Ct)值≤38 時為陽性，反之則為無效。結(jié)核分枝桿菌陽性的診斷標準為 5個探針中至少2個探針Ct 值≤38，并可進一步按照Ct值對樣本中的結(jié)核分枝桿菌進行半定量分析，Ct值<16為高荷菌量，16～22為中等荷菌量，>22～28為低荷菌量，>28為極低荷菌量。檢測利福平是否耐藥是基于結(jié)核分枝桿菌特異分子探針最早期的Ct值和晚期的Ct值之差，即ΔCt值，系統(tǒng)設(shè)置的判斷標準為當ΔCt>3.5時判斷為對利福平耐藥，當ΔCt≤3.5時判斷為對利福平敏感[3]。約2 h后，反應(yīng)結(jié)束，讀取檢測結(jié)果并打印存檔。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計處理。靈敏度和特異度的計算以臨床診斷為參考標準。涂片法、培養(yǎng)法和GeneXpert MTB/RIF檢測用于肺結(jié)核診斷的靈敏度、特異度比較采用χ2檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13種方法的檢測結(jié)果 對照組中，2例支氣管擴張患者培養(yǎng)法檢測陽性，后來送相關(guān)機構(gòu)鑒定，1例為非結(jié)核分枝桿菌，另1例為弱抗酸的諾卡菌屬，并非分枝桿菌；但當時培養(yǎng)基上的形態(tài)及菌落涂片鏡下觀察顯示為抗酸桿菌，被誤認為是分枝桿菌。觀察組中，未見利福平耐藥的患者。見表1。

表1 兩組患者結(jié)核涂片法、培養(yǎng)法、GeneXpert MTB/RIF檢測結(jié)果[n(%)]

2.2靈敏度和特異度的比較 3組間靈敏度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.013);然后進行兩兩比較，GeneXpert MTB/RIF與涂片法的靈敏度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。3組間特異度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.132)。見表2。

表2 涂片法、培養(yǎng)法、GeneXpert MTB/RIF診斷效能的比較(%)

3 討 論

結(jié)核病的快速診斷是其防控的關(guān)鍵。GeneXpert MTB/RIF作為快速診斷結(jié)核的利器，自問世以來，在肺結(jié)核和肺外結(jié)核的診斷應(yīng)用中進行過諸多評估。國外有學(xué)者做了大樣本的肺結(jié)核GeneXpert MTB/RIF的應(yīng)用評估，得出涂片法、GeneXpert MTB/RIF、培養(yǎng)法在肺結(jié)核診斷中的靈敏度分別為18.90%、23.85%和20.35%[7]。國內(nèi)學(xué)者也得出GeneXpert MTB/RIF、涂片法和培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌的靈敏度和特異度分別為 37%和 99%、17%和 98%、37% 和 95%[8]。GeneXpert MTB/RIF用于痰標本檢測的優(yōu)勢顯而易見。對于BALF，國內(nèi)有學(xué)者做過BALF的GeneXpert MTB/RIF檢測研究，特別是針對菌陰肺結(jié)核，得到的靈敏度數(shù)據(jù)不一致，但特異度較一致[9-13]。本研究以臨床診斷為標準，涂片法、培養(yǎng)法、GeneXpert MTB/RIF檢測對于肺結(jié)核診斷的靈敏度和特異度分別為13%和100%、21%和96%、30%和100%，與勞海黎等[9]的結(jié)果較為一致。與其他幾位學(xué)者的結(jié)果[10-13]比較，本研究的靈敏度略低，韓丹等[10]和李妍等[11]報道的靈敏度高達60%，這可能是因為本研究選擇的都是無痰和少痰的患者，肺部炎癥輕，滲出少，結(jié)核分枝桿菌載量少，而在特異度方面較為一致。

GeneXpert MTB/RIF檢測與涂片法的靈敏度差異有統(tǒng)計學(xué)意義；GeneXpert MTB/RIF與培養(yǎng)法的靈敏度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與張志學(xué)等[13]的報道相符。另外，3種方法在特異度方面無明顯差異，甚至培養(yǎng)法在對照組也檢出2例陽性，后經(jīng)鑒定，檢出的菌株并非分枝桿菌，培養(yǎng)法的特異度因此降為96%。另外，從檢測時效性方面考慮，GeneXpert MTB/RIF檢測只需耗時2 h就有結(jié)果，培養(yǎng)法卻需要3～4周才會有陽性結(jié)果，GeneXpert MTB/RIF檢測有很大的優(yōu)勢。更重要的是，GeneXpert MTB/RIF檢測以rpoB基因為靶基因，能正確鑒定出 97.6%的利福平耐藥菌株[14]，與比例法測得的利福平耐藥結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義[15]。

綜上所述，用BALF做GeneXpert MTB/RIF檢測，特異度高，靈敏度明顯高于傳統(tǒng)的BALF涂片法，用時短，而且能快速判斷是否對利福平耐藥，對于無痰和少痰肺結(jié)核患者的快速診斷有較大的價值。