自動紅細胞比容校正全血CRP測試結果特定蛋白分析儀的系統設計

陳月玲，王永強，鄭繼波，陳蘭蘭

1.山東大學附屬山東省耳鼻喉醫院眩暈科，山東濟南250022；2.濟南市第四人民醫院器材設備管理科，山東濟南250031；3.山東省立第三醫院信息網絡部臨床醫學檢驗部，山東濟南250021；4.山東大學附屬山東省立醫院 臨床醫學檢驗部，山東濟南250021

引言

目前，國內外關于紅細胞比容（Hematocrit，HCT）對全血C-反應蛋白（C-Reactive Protein，CRP）檢測的影響及其校正方法的研究成果有很多[1-4]，如田野等[2]通過試驗得出全血CRP水平與HCT值呈顯著負相關關系的結論，并推導了使用HCT值校正全血CRP值的公式。隆維東等[4]測定并計算了最佳理論HCT范圍。但能夠實現一臺設備同時實測HCT及CRP值，并使用HCT值對全血CRP檢測結果校正的分析儀卻很少。在臨床檢驗科室的測試實踐中，當遇到HCT偏離正常值的樣品時，不得不人工校正后發布報告。因此，本文設計一款可實現自動測量HCT及CRP值，并進行自動校正的全自動化儀器。

1 系統設計

1.1 工作原理

采用散射比濁法[5-8]設計光學部件，采用散射光對全血樣本進行HCT測定，自動對CRP測試值進行校正。

散射光檢測原理描述如圖1所示，采用650 nm波長的激光I0沿水平軸入射，通過待測樣本時，光線被粒子顆粒散射，發生偏轉，根據Rayleigh散射方程，散射光強度與粒子（免疫復合物）的濃度和體積成正比，即待測物越多，反應后形成的粒子也越多，散射光強度也越強。通過測量散射光的強度，可計算出待測抗原的濃度。

圖1 散射比濁法示意圖

1.2 系統結構

本系統主要由機械結構和電路系統組成。

1.2.1 機械結構設計

機械結構組件[9-10]由七大模塊組成，分別為：進樣架模塊、樣本針模塊、試劑針模塊、攪拌針模塊、反應盤模塊、試劑盤模塊、機架模塊。機械結構組件分解圖如圖2所示。

圖2 機械結構模塊

1.2.1.1 進樣架系統

進樣架系統主要由進樣位、出樣位，推動樣本架的步進電機、相關導軌、同步帶、傳感器等組成，當樣本架放入進樣位后，由步進電機驅動擋片將樣本架推至吸樣位，完成吸樣后，再由擋片將樣本架推至出樣位，完成自動進樣。

1.2.1.2 樣本針模塊

樣本針模塊用于將血液樣本添加至反應杯中，具有液面探測功能及垂直方向的防撞功能。

1.2.1.3 試劑針模塊

試劑針模塊用于將試劑盤模塊中低溫存儲的試劑抽吸到反應杯中，同樣具有液面探測及垂直方向防撞功能。

1.2.1.4 攪拌針模塊

攪拌針模塊用于將樣本與稀釋液，或兩者混合液與第二試劑進行混勻，保證充分反應。

1.2.1.5 反應盤模塊

反應盤用于承載反應杯，具有加熱功能，保證免疫反應處于恒溫37℃的環境中。安裝有光學測試模塊，采用激光光源，激光透過反應杯后，被光學感應模塊接收。反應盤帶有編碼盤，編碼盤與傳感器組件共同保證反應盤按需求轉動到不同位置，進行加樣、加試劑、攪拌及測試等工作。

同一樣本對HCT及CRP測試時，需要使用兩個反應杯，第一反應杯注入稀釋液后，樣本針將全血樣本注入該反應杯中，測定該樣本的HCT，測試完成后，由樣本針從第一反應杯中吸取一定量樣本注入第二反應杯中，由試劑針注入試劑，反應完成后再次使用散射法對第二反應杯中的混合樣進行CRP值的測試，并使用第一反應杯中測的HCT對CRP值進行校正。

1.2.1.6 試劑盤模塊

試劑盤模塊與反應盤模塊控制方式類似，同樣使用編碼盤進行定位和轉動控制。為避免在機試劑蒸發或溫度原因導致的試劑在機時間縮短，試劑盤配有制冷模塊。

1.2.1.7 機架模塊

機架模塊包含整機的手板件外殼、用于承載其他模塊的機加工件或鈑金件等。

1.2.2 硬件結構設計

1.2.2.1 設計原則

整機布局應注意大功率器件，應布在電路板邊緣，電機、泵、閥驅動電路設計為獨立單元，避免大功率器件在啟動、運行及停止時產生的噪音影響其他系統的正常運行。儀器電路板較多，運動機構復雜[11-12]，要充分考慮印刷電路板（Printed CircuitBoard Assembly，PCBA）的連接線、風道的設計。電路板與液路應分開，液路采用兩段或多段連接的方式，方便拆卸維修。同一邏輯運動下的功能實現應盡量在同一單元內完成，減少PCBA之間的通訊。

1.2.2.2 架構設計

為降低研發風險，提高產品的擴展性，采用目前廣泛應用的微處理器ARM（Advanced RISC Machines，ARM）平臺[13-14]。ARM單片機與上位機進行通訊，設備運行邏輯、數據計算等由上位機完成。

選用意法半導體的STM32F407V單片機，使用CortexIM-M4為內核作為主控芯片，負責整個硬件平臺的指令控制、數據運算及信號處理，通過設備內的光電傳感器采集數據，然后通過主控芯片內相應的模塊進行信號處理，再通過中央處理器進行算法控制，解析出結果值并在上位機上顯示[15-17]。

主控板使用串口與上位機通訊，主控板與各驅動板之間則使用控制器域網（Controller Area Network，CAN）通訊。

上位機與主控板及各模塊控制板之間的通訊如圖3所示。主控板及各模塊控制板實物圖如圖4～6所示。主控板為控制中樞，包括控制電源，各運動機構的運行邏輯控制等。各模塊控制板則用于本模塊的驅動及控制，并將結果通過主控板反饋至上位機系統。

2 軟件設計

上位機軟件負責界面的操作、結果的顯示，可進行樣本測試、質控測試、定標測試的申請；以及查詢、打印等必備的輔助功能。

圖3 硬件通訊拓撲

圖4 主控板

圖5 針類模塊控制板

圖6 盤類模塊控制板

下位機進行時序控制、邏輯控制、數據運算等，將分析后的結果傳送到上位機，在上位機顯示界面上顯示。

上位機軟件，人機交互功能的設計如圖7所示，軟件系統分為菜單、試劑、任務、指控及結果模塊。菜單為功能入口，提供各類功能的接入；試劑模塊則用于顯示試劑剩余量、批號等相關信息；任務入口用于新增測試樣本信息的錄入，其中需要選擇樣本為全血標本還是血漿/血清標本；質控則用于儀器質控結果的查看及匯總功能等，同時質控測試時，信息錄入也在本窗口；結果則為樣本測試結果的匯總顯示、查詢等。

圖7 人機交互功能

在儀器進入工作狀態時，主程序首先對儀器的電路進行整機初始化，檢查儀器的各運行動作是否異常，在確認無異常后，儀器自動進行日檢，日檢執行完成后，儀器檢測清洗桶清洗液的用量、試劑位等的檢測。檢測完成后，可進入執行流程環節，流程結束后輸出結果。具體流程如圖8所示。

圖8 系統流程圖

3 性能測試與驗證

本分析儀采用了良好的人機交互設計，方便操作者使用。儀器的實物圖如圖9所示。人機交互界面如圖10所示。

圖9 產品實物圖

圖10 人機交互界面

3.1 性能驗證

CRP存在于人血漿或血清中，HCT會對該項目的測試結果產生較大影響。因此，本儀器設計時，采用散射光對全血樣本進行特定蛋白濃度及HCT的測定，實現自動HCT校正全血CRP測試結果。

使用CRP試劑及配套的定標品、質控品及血清樣本，對設備進行定標，并進行質控測試，質控通過后，對設備進行準確度、重復性及線性的測試[18-19]。

3.1.1 準確度

儀器準確度采用編號為ERM-DA474/IFCC的CRP標準物質進行測試，靶值為41.2 mg/L。對標準物質測定3次，測試結果記為(xi)，分別為 43.3、43.1、42.8 mg/L計算相對偏差結果分別為5.10%、4.61%和3.88%，按照CRP測定試劑盒行業標準[20]，相對偏差應≤15%。

3.1.2 重復性

使用高、低值臨床血清樣本對儀器進行測試，計算標準偏差及變異系數，變異系數應當不大于10%[20]，測試結果表明在臨床高值樣本測試結果CV值為0.79%，低值樣本測試結果CV值為3.4%，結果均優于標準要求。

3.1.3 線性

采用高值臨床血清樣本，按照原倍、1/2、1/4、1/16、1/64、1/400的稀釋比例進行線性測試，計算線性相關系數。測試數據結果顯示線性相關系數R為0.9998。

通過上述測試表明，在使用血清樣本時，本文中設計開發的特定蛋白儀具有良好的實用性。

3.2 全血樣本的CRP測試及結果校正

3.2.1 HCT與全血CRP數值的線性關系

對全血CRP進行測試時，對測試結果進行了換算，換算為與血漿樣本等值的結果見式(1)。

式中：CRPW-全血CRP濃度值；

CRPWR-全血CRP濃度值實測值；

HCt-固定HCT。

其中Hct值為特定蛋白儀內置可修改參數，一般設置為40%。

將公式(1)編程輸入軟件系統中，則在測試獲得結果后，使用固定的HCT40%自動校正全血測試結果。

由上式可看出，全血CRP濃度值與HCT成線性關系。驗證如下。

采集正常體檢人員EDTA抗凝血兩管，第一管使用3000 r/min離心10 min，第二管靜置發生血沉后，用移液槍吸取底層紅細胞，或滴加第一管血漿，并充分混勻的方式，分別使用Sysmex XN-2000儀器測試HCT，以及本文所研發的特定蛋白儀測試全血CRP濃度。二者關系如圖11所示。

3.2.2 HCT的測定

為實現使用HCT對全血CRP進行校正，本儀器采用散射光測試的方法，獲得HCT數值。

全血樣本被吸注到預先加入了稀釋液的反應杯中，反應盤將該反應杯旋轉至測試位，獲得散射光強度值，并通過曲線獲得HCT值，利用該HCT值進行校正。散射光強度值（為方便表示，對散射光強度進行了換算）與HCT的關系如圖12所示。

圖11 全血CRP濃度與HCT的線性關系

圖12 HCT與散射光強度值

由圖12可知，HCT與散射光強度值有線性關系，因此，可使用二者關系建立標準曲線，用于根據散射光強度計算HCT值。

3.2.3 利用HCT對全血CRP的校正

使用3.2.1中以獲得的實驗數據。根據隆維東[4]等研究結論，校正計算的公式為式(2)。

將公式(2)輸入至儀器計算程序中。

取3.2.1中，梯度HCT樣本，使用修改了校正公式特定蛋白儀進行全血CRP測定。每個標本測定三次，取平均值列于表1校正值一列。

表1 不同HCT校正CRP值

根據隆維東等[4]的結論，當 HCT 處于（36.0±3.5）%范圍時，全血標本在使用式(1)的方式校正時，與血清標本直接測試結果無統計學差異。故以HCT38%樣本CRP濃度為該樣本真值（49.15 mg/L），使用該真值計算與所有校正值的相對偏差，列于表1相對偏差一列。不同HCT梯度的同一來源樣本的CRP測試結果均得到了校正，符合標準要求[20]。

4 結論

本儀器設計的HCT測試功能獲取的HCT值精確度雖無法與血球儀精度相媲美，但可以有效的校正CRP的值，濃度值的相對偏差，均小于15%，可以滿足臨床要求。

本分析儀其進樣架系統具有一定的先進和優越性，可以避免人工因素的影響，大幅度提高檢測效率；樣本針、試劑針和攪拌針，三個模塊分工協作，可以極大的提高運行效率；配合清洗部分，可以減少一定耗材損耗，降低使用成本；反應盤和試劑盤模塊都采用特殊設計的編碼盤，根據任務需求，轉動到不同的部位，反應盤配合檢測系統，可以準確無誤的進行判別，提高診斷的準確性以及檢測效率；試劑盤配合冷卻模塊，可以減少試劑的損耗，降低一定的使用成本。

本分析儀的硬件部分，采取電路板和液路分開布置，電路板以及液路部分都在儀器邊緣位置，方便拆卸，對后續的售后維護提供了極大的便利。本分析儀的軟件部分，采用良好的人機交互界面，通俗易懂，方便使用者的操作。

本分析儀沒有加入閉蓋穿刺功能和獨立的急診位，這兩個不足之外將會是我們以后研究和完善的方向。量產機可參考本文的設計思路，加入閉蓋穿刺、設立急診位等方便臨檢的功能。可靠的質量、持續穩定的設備運行，是臨檢科室的主要要求，新開發的設備，應當進行足夠時間的可靠性試驗，運行穩定性試驗等，在充分驗證設備可靠性基礎上注冊并量產。