一株產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌的分離鑒定及發(fā)酵條件研究

金楚杰，吳津，郭偉鑫，勞吳榮，楊鴻，李鵬

(浙江海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江 舟山 316022)

蛋白酶(protease)是重要的工業(yè)酶，常存在于微生物及動、植物中，其應(yīng)用廣泛，在食品、環(huán)保、絲綢、醫(yī)藥、飼料、制革、洗滌劑、飼料等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[1-3]。目前對于海洋來源的堿性蛋白酶研究主要集中在篩選新型堿性蛋白酶和產(chǎn)酶菌株，近幾年有研究報導(dǎo)了一些具有較高pH適應(yīng)性的海洋來源的菌株[4-6]。海洋微生物處在低溫、高壓、高鹽等的極端環(huán)境中，其代謝產(chǎn)物與陸生微生物相比結(jié)構(gòu)更加新穎，更適合用于極端條件。Sreeja等[7]從海洋細(xì)菌株EngyodontiumalbumBTMFS10中分離到堿性絲氨酸蛋白酶，該酶在部分有機(jī)溶劑和表面活性劑中均具有良好的穩(wěn)定性，具有耐高溫、高pH值的特點。Anjali等[8]從海洋細(xì)菌BacillustequilensisP15的代謝產(chǎn)物中分離到堿性蛋白酶，實驗結(jié)果顯示該酶在制革、絲綢方面都具有很好的應(yīng)用前景。

舟山海域具有豐富的海產(chǎn)資源，水產(chǎn)品加工企業(yè)較多，魚蝦蟹貝類等的加工下腳料利用率較低，從下腳料中篩選出具有高酶活性的產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌，并應(yīng)用于飼料行業(yè)，具有很好的研究前景。本研究篩選來源于下腳料的產(chǎn)蛋白酶海洋細(xì)菌，對其進(jìn)行初步研究，并為下一步在基因克隆等方面打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

購買并收集舟山本地興業(yè)集團(tuán)的水產(chǎn)品下腳料，裝于無菌采集瓶，置于4 ℃冰箱，并盡快處理。

1.2 培養(yǎng)基

脫脂奶培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，瓊脂20.0 g，溶解于1 L海水中，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4，121 ℃高壓滅菌20 min。脫脂牛奶10.0 g，溶于1 L海水中，115 ℃高壓滅菌30 min。于超凈工作臺混勻備用。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，溶解于1 L海水中，121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脫脂奶10.0 g，溶解于海水1 000 mL，pH 8.5，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.3 菌株的分離和篩選

取10 g下腳料，用組織搗碎機(jī)粉碎后置于加入90 mL無菌水的三角燒瓶中(內(nèi)裝玻璃珠)，搖床震蕩30 min充分混勻，進(jìn)行梯度稀釋，即取0.5 mL樣品加入裝4.5 mL無菌水的試管中，即得樣品濃度為10-2，依次制備10-3～10-6濃度，取10-4～10-6樣品0.1 mL涂布于脫脂奶培養(yǎng)基中，每個濃度至少做9個重復(fù)，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，待菌落生長后觀察有無透明圈產(chǎn)生，挑取周邊有透明圈的菌落進(jìn)行劃線(脫脂奶平板中)，重復(fù)3次，得到純菌株。

1.4 蛋白酶活性的測定

將篩選到的菌株接種于種子培養(yǎng)基，28 ℃，120 r·min-1，培養(yǎng)20 h，取1 mL種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝瓶量50/250 mL，28 ℃，120 r·min-1，培養(yǎng)48 h后，5 000 r·min-1離心，取上清粗酶液，利用Folin-酚法進(jìn)行酶活測定。

蛋白酶活力：以酪蛋白為底物，每分鐘水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個酶活力單位。

1.5 菌株的分子鑒定

由天根生化科技(北京)有限公司提供試劑盒(TIANamp BacteriaDNA Kit)提取染色體DNA，利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，后利用產(chǎn)物純化試劑盒回收，回收的DNA進(jìn)行測序，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。測序得到的序列，上傳BLAST進(jìn)行比對，比對結(jié)果采用MEGA 4.0的鄰接方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[9-11]。

1.6 單因素實驗

將斜面保種純菌株，先用種子培養(yǎng)基進(jìn)行活化，按照接種量5%分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行單因素實驗。分別取培養(yǎng)時間24、36、48、60、72 h的發(fā)酵液，NaCl濃度為1 g·L-1，初始pH 7.5，發(fā)酵溫度為30 ℃，進(jìn)行酶活的測定；分別調(diào)整發(fā)酵液的初始pH值為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，NaCl濃度為1 g·L-1，測酶活；分別調(diào)整1 L發(fā)酵液中NaCl的含量5、15、25、35、45 g，培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，培養(yǎng)時間48 h，初始pH 7.5，測酶活；培養(yǎng)溫度分別在25、30、35、40、45、50 ℃，培養(yǎng)時間為48 h，初始pH 7.5，培養(yǎng)時間48 h，NaCl濃度為1 g·L-1，測酶活。

1.7 BBD響應(yīng)面分析法

利用Box-Behnken(Design-expert 10.0 USA)對影響酶活的3個最主要因素進(jìn)行觀察，進(jìn)行培養(yǎng)條件最優(yōu)化設(shè)計，確定最佳實驗條件，并進(jìn)行實驗驗證，確定精確度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

脫脂平板篩選結(jié)果顯示，從魚蝦蟹等下腳料中篩選到一株有較大透明圈的海洋蛋白酶生產(chǎn)細(xì)菌菌株，菌落在脫脂平板中產(chǎn)黑棕色色素，產(chǎn)生的透明圈較大，透明圈直徑/菌落直徑為3.8(圖1)。

圖1 脫脂平板的篩選結(jié)果

2.2 酶活測定

先繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線如圖2所示，其中R2=0.997 4，曲線表現(xiàn)出較好的線性相關(guān)性。利用Folin-酚法進(jìn)行酶活測定，將測試的樣品吸光值帶入公式，重復(fù)實驗2次，取平均值，得到最終的粗酶活性為88.6 U·mL-1。

圖2 酪氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 菌株鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行，將序列上傳至NCBI的BLAST進(jìn)行比對，后用MEGA 5.0的鄰接(N-J)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，并將序列上傳至GenBank，獲得菌株的登錄號為MK053886。該菌株與BacillscereusHFBP18、BacillscereusATCC 141579等菌株在進(jìn)化關(guān)系上最近，相似性達(dá)到100%，菌株SP1屬于蠟樣芽胞桿菌Bacillscereus，因此，命名菌株SP1為BacillscereusSP1。

圖3 菌株SP1的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 單因素實驗

分別觀察不同培養(yǎng)時間(24、36、48、60、72 h)、不同初始pH值(7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)、不同NaCl濃度(5、15、25、35、45 g·L-1)以及不同培養(yǎng)溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)的酶活變化曲線，結(jié)果如圖4所示。

單因素實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)時間為48 h、pH在7.0～8.5、NaCl濃度25 g·L-1、培養(yǎng)溫度40 ℃時，菌株的酶活性最強(qiáng)，酶活的曲線均表現(xiàn)為先升高再降低。同時在NaCl濃度為45 g·L-1時也表現(xiàn)出較好的酶活，說明該菌株具有較好的鹽度耐受性。

2.5 BBD響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)條件

為了優(yōu)化培養(yǎng)條件，選擇3個關(guān)鍵因素A培養(yǎng)溫度、B初始pH值、CNaCl濃度，采用Design-Expert 10.0軟件響應(yīng)面設(shè)計中的Box-Behnken方法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(表1)。其中以酶活作為響應(yīng)值，設(shè)計17組實驗進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計。

將3個因素進(jìn)行組合，得到一個17次實驗結(jié)果，輸入Design-Expert 10.0軟件，得到相應(yīng)的二次方回歸方程，其中Y表示響應(yīng)值。

Y=92.4-7.51A-7.00B-8.59C+4.45AB+4.97AC-4.35BC-17.89A2-9.06B2-5.09C2。

對實驗結(jié)果進(jìn)行方差及顯著性的分析，模型的P值<0.000 1，說明該模型顯著。分析結(jié)果顯示，因素A、B、C3個因素的P值分別為0.000 2、0.000 2及<0.000 1，均<0.05，表明該3個因素均影響顯著。失擬項的F值是0.77，意味著缺乏擬合相對于純誤差不顯著，“Adeq Precision”表示該模型的精密度，用于測試信噪比，當(dāng)模型的“Adeq Precision”值≥4時，表明該設(shè)計模型符合要求。分析結(jié)果顯示此次模型的“Adeq Precision”值為16.67，充分說明該模型設(shè)計符合對三因素的優(yōu)化。

圖4 單因素對酶活的影響

表1 3種因素水平及對酶活的影響

關(guān)于3個因素之間交互影響的結(jié)果，如圖5所示。從圖中可以看出，3個因素中B、C的交互影響最小，從顯著性分析也可以看出B、C的P值最大，為0.019 8，在設(shè)計培養(yǎng)條件時，應(yīng)該優(yōu)先考慮P值最小的兩因素之間的交互作用，該模型結(jié)合顯著性分析顯示A和C之間的交互影響最大，A、C的P值為0.010 9，因素A和C直接交互作用的3D和等高線圖，如保持NaCl濃度不變，蛋白酶活性隨著溫度升高，后快速下降，在優(yōu)化培養(yǎng)條件時，應(yīng)優(yōu)先考慮NaCl濃度對酶活的影響。

圖5 3種因素對功率密度交互影響的三維曲面和等高線

求導(dǎo)回歸方程，得到三因素的真實值分別為A=35.7 ℃；B=7.7；C=1.07 g·L-1，此時的酶活為97.65 U·mL-1。重新調(diào)整培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl濃度為20.7 g·L-1、培養(yǎng)時間48 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1，5%的接種量，實際酶活為101.8 U·mL-1，比優(yōu)化前的酶活88.6 U·mL-1提高了14.9%，預(yù)測精度達(dá)到95.8%，同時也證明采用響應(yīng)面BBD法進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計的可行性。

3 小結(jié)與討論

從舟山海水加工廠廢棄魚蝦蟹等下腳料中分離篩選到一株產(chǎn)堿性蛋白酶的海洋細(xì)菌，使用Folin-酚法進(jìn)行酶活測定，初始酶活為88.6 U·mL-1，利用16S rDNA進(jìn)行分子鑒定，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹結(jié)果顯示該菌株屬于蠟樣芽胞桿菌，并命名為BacillscereusSP1。單因素實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)時間48 h、初始pH 8.5、NaCl濃度25 g·L-1、培養(yǎng)溫度40 ℃時對應(yīng)的酶活性最高。Box-Behnken Design方法進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化設(shè)計培養(yǎng)條件，結(jié)果表明,培養(yǎng)溫度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl濃度為20.7 g·L-1、培養(yǎng)時間48 h，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1，5%的接種量，實際酶活為101.8 U·mL-1，比優(yōu)化前的酶活提高了14.9%，預(yù)測精度達(dá)到95.8%。

目前，產(chǎn)蛋白酶的微生物的研究主要包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等[12-14]。蛋白酶是一類在堿性pH值范圍時，能高效水解蛋白質(zhì)的一類酶，其分子量大概在26 000～34 000 Da，大部分蛋白酶具有絲氨酸活性中心，并具有很強(qiáng)的底物特異性[15]。研究具有特殊性能的堿性蛋白酶以及蛋白酶工程菌是目前的熱點[16]，K. Adinarayana等[17]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在60 ℃環(huán)境中仍具有較好的酶活穩(wěn)定性能。馮清平等[18-19]篩選到一株嗜堿性的地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis53-A6，經(jīng)過選育，獲得了一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株。劉成圣等[20]從海洋弧菌Vibrio pacini X4B-7的發(fā)酵液中獲得產(chǎn)堿性蛋白酶，研究發(fā)現(xiàn)該酶對DNA酶具有專一地降解作用。

海洋的低溫、高壓、高鹽等極端環(huán)境，導(dǎo)致海洋微生物具有別于陸生微生物的不同代謝途徑，其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)往往更加新穎，更適合用于極端條件的研究。本研究獲得的來源于魚蝦蟹下腳料中的海洋產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌，為更好利用海洋資源，構(gòu)造高產(chǎn)蛋白酶工程菌提供一定的研究基礎(chǔ)。