一種新型貝殼基質蛋白的重組表達與功能分析

孫琦，姜雨婷，徐煥志，申望，張曉林，范美華，廖智

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，浙江舟山 316022）

貝殼是一類天然的具有納米結構層次的生物礦化材料，其鈣化層中，無機成分超過95%，主要為碳酸鈣晶體，有機質成分含量較低，通常在5%以下［1］。其中，蛋白質是有機成分的主體，被稱為貝殼基質蛋白（shell matrix protein，SMP）。自然界中碳酸鈣晶體主要包括三種晶型，分別是方解石型（calcite）、文石型（aragonite）和球霰石型（vaterite）［2］。軟體動物貝殼中的碳酸鈣晶體主要有熱力學性質穩定的方解石型和文石型兩種，其中天然方解石型晶體多為規則立方體，而文石型晶體的形貌則取決于誘導條件，情況較為復雜［3］。貝殼生物礦化一般發生在有機-無機界面，碳酸鈣晶體的形成與沉積，包括成核、生長、晶型以及形貌形成等受SMP 調控［4］；此外，貝殼中由幾丁質等非蛋白質成分構成的有機框架的形成也受SMP 調控［5］。可見，SMP 在貝殼的形成以及力學性能賦予方面具有重要作用。SMP 根據其在醋酸溶液或EDTA 溶液中的溶解性分為可溶性蛋白和不溶性蛋白兩大類，其中不溶性SMP 和幾丁質等共同參與貝殼中疏水性有機框架的搭建［6］；而可溶性SMP 則主要負責誘導碳酸鈣晶體的成核并調控其生長［7］。目前已報道的多數SMP 富含某一種或某幾種氨基酸殘基，例如富含酸性氨基酸殘基（天冬氨酸和谷氨酸）的SMP 已被證實與生物礦化密切相關［8］；而側鏈較小的氨基酸殘基，包括甘氨酸和丙氨酸等，在部分SMP 序列中的高度聚集分布也被認為與SMP 形成模塊化結構有關，并對生物礦化有重要影響［9］。

厚殼貽貝（Mytilus coruscus）貝殼主要由珍珠質層、肌棱柱層和纖維棱柱層構成［10］。此前已有研究利用蛋白質組學策略從厚殼貽貝貝殼中鑒定到超過60 種SMP 成分，包括碳酸酐酶、幾丁質結合蛋白、絲蛋白、酪氨酸酶、蛋白酶抑制劑等［11］。其中，一種富含谷氨酰胺的貝殼蛋白（Glutamine-rich shell protein，GRSP）在厚殼貽貝貝殼肌棱柱層中被鑒定到［11］，但其在生物礦化過程中的作用及其分子機理目前尚不清楚。厚殼貽貝GRSP 序列中含有一個PDZ （postsynaptic density/discs large/zonula occludens）結構域和一個ZM（ZASP-like motif）結構域，已知含這兩種結構域的蛋白在生物體內分布廣泛，被認為是參與蛋白質相互作用的關鍵結構域［12］。為探究GRSP 在貝殼形成過程中可能發揮的作用，筆者對厚殼貽貝貝殼的GRSP 進行了序列分析，對原核重組表達以及重組GRSP 的功能進行了研究。結果表明，重組厚殼貽貝GRSP 對碳酸鈣晶體的結晶速度、晶體形貌和晶型均有影響，由此推測GRSP 與貝殼的形成及發育具有重要關聯。上述研究為進一步探討GRSP 在厚殼貽貝貝殼形成過程中的分子機理奠定了基礎，也為GRSP 的后續蛋白質工程改造提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 厚殼貽貝GRSP 的序列分析

厚殼貽貝GRSP 的基因序列已入GenBank 數據庫，編號為AKS48171.1，通過生物信息學手段開展蛋白序列分析。其中，用Lasergene 軟件（版本7.0）確定開放閱讀框；用DNAman 軟件進行序列比對；通過Expasy 數據庫的protparam 軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）在線進行蛋白質的理化性質分析；在NCBI 網站上利用BLAST 軟件（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在線進行同源序列搜索；在MEGA 軟件（版本5.1）上進行多序列比對和進化樹分析；用SMART 軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線進行結構域預測；用Signal P 5.0 軟 件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/））在線進行信號肽預測；用Phyre2軟件（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/）在線進行蛋白二級結構預測；通過SWISS MODEL 服務器（https：//swissmodel.expasy.org/）在線進行蛋白三級結構預測。

1.2 GRSP 的密碼子優化與表達載體的構建

為獲得適合大腸桿菌表達體系的目標基因，對厚殼貽貝GRSP 的cDNA 成熟肽編碼的基因序列（1 788 bp）進行大腸桿菌偏愛密碼子優化。在目標基因5' 端添加NcoI 限制性內切酶切位點（CCATGG）和多聚組氨酸標簽；3'端添加終止密碼子（TAA）和XhoI 酶切位點（CTCGAG）；最終設計出的目標基因全長1 817 bp。該目標基因由南京金斯瑞公司合成。合成后對PDZ 序列進行測序驗證。表達載體采用Pet28α（+）質粒，經雙酶切后，用T4-DNA 連接酶將目標基因序列與表達質粒酶切片段連接，連接產物經測序驗證后轉至大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞中。轉化后的重組菌涂布于含氨芐青霉素的LB 平板，經37 ℃過夜培養，挑取單克隆菌落進行PCR 鑒定，將陽性克隆結果送至上海生工生物公司進一步測序驗證。

1.3 重組厚殼貽貝GRSP 的表達、純化及鑒定

參照文獻［13］中的方法開展重組厚殼貽貝GRSP 的原核重組表達。表達產物采用Ni-NTA 親和層析柱純化。目標蛋白經鎳柱分離純化后，參照文獻［14］中的方法進行透析復性處理。對復性后的目標蛋白進一步采用反相高效液相質譜（Waters 600 E 型，美國沃特世公司）進行脫鹽和純化。檢測器為Waters 2487 雙波長紫外檢測器（美國沃特世公司）；色譜柱為 C4 反相色譜柱（4.6 mm×250 mm，300 ?，安捷倫）；采用二元線性梯度洗脫，其中A 液為含0.1% 三氟乙酸的純水，B 液為含0.1%三氟乙酸的乙腈；B 液在35 min 內，其比例由30% 升 至70%；流速為1 mL·min-1；檢測波長為280 nm。收集目標洗脫峰，經冷凍干燥后備用。

SDS-PAGE 采用12%分離膠，以及120 V 恒壓模式，結束后用醋酸液固定20 min，以考馬斯亮藍G250 染料染色后拍照觀察。

1.4 重組厚殼貽貝GRSP 的功能分析

重組厚殼貽貝GRSP 的功能分析主要包括碳酸鈣晶體形貌分析、晶體晶型分析、結晶速度分析以及晶體結合分析。采用體外碳酸鈣結晶誘導法［15］分析碳酸鈣晶體形貌，其中，在制備方解石型碳酸鈣晶體時，將CaCl2溶液置于事先放置（NH4）2CO3固體的玻璃干燥皿內進行結晶，利用（NH4）2CO3揮發出的CO2與CaCl2溶液反應獲得方解石型碳酸鈣晶體；在上述方法基礎上，預先在CaCl2溶液中按物質的量之比為1∶4 添加MgCl2溶液，在Mg2+誘導下，CaCl2與CO2反應形成文石型碳酸鈣晶體［16］。在上述反應體系中，加入重組GRSP 蛋白溶液，蛋白溶液終濃度分別為0，10，30 和50 μg·mL-1。在重組GRSP 誘導下形成的碳酸鈣晶體經真空噴金處理，以場發射掃描電子顯微鏡（Nova nano SEM 450，美國FEI 公司）觀察晶體形貌。掃描電鏡采用二次電子模式收集信號，加速電壓為5 kV，束斑直徑為3.0 mm，工作距離為6.0～7.0 mm。

采用傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）并參照文獻［13］中的方法進行碳酸鈣晶體的晶型分析。采用Nicolet Nexus 670 紅外光譜儀（美國熱電公司）以透射模式測量上述步驟中經50 μg·mL-1重組GRSP 誘 導下形成 的碳酸鈣 晶體。掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數為32，分辨率為4 cm-1。采用Omnic 軟件（版本8.2.387）對紅外譜圖進行分析處理。

參照文獻［13］中的方法進行碳酸鈣結晶速度抑制。在CaCl2溶液中加入不同濃度的重組厚殼貽貝GRSP，利用（NH4）2CO3固體所揮發的CO2與CaCl2溶液反應形成碳酸鈣晶體。上述反應在96 孔板中進行，用酶標儀（Biotec H1，美國博騰公司）在600 nm 波長處進行掃描，觀察碳酸鈣晶體形成過程中溶液濁度的變化。

參照文獻［13］中的方法進行重組厚殼貽貝GRSP 與碳酸鈣晶體的結合實驗。事先配置0.5 mg·mL-1重組GRSP 溶液（溶液A），加入碳酸鈣晶體粉末，震蕩混勻后室溫孵育2 h，離心（8 000 r·min-1，15 min）后取上清（溶液B）備用；經去離子水洗滌后用5%醋酸溶液溶解沉淀物，脫鈣、離心、透析后，獲得溶液C。對溶液A，B，C 分別進行SDSPAGE 電泳分析。

2 結果

2.1 厚殼貽貝GRSP 是一種含PDZ 結構域的新型貝殼基質蛋白

厚殼貽貝GRSP 基因的開放閱讀框全長1 788 bp，可編碼由595 個氨基酸殘基組成的前體蛋白，其理論分子質量為67.7 kDa，等電點pI 為9.37，是一種堿性蛋白。其核苷酸-氨基酸序列比對如圖1 所示。氨基酸組成分析結果表明，厚殼貽貝GRSP 序列中含量最豐富的氨基酸為谷氨酰胺（Gln，18.2%），其次分別 為脯氨 酸（Pro，13.6%）和絲氨 酸（Ser，7.2%）。同源蛋白搜索結果表明，厚殼貽貝GRSP 在數據庫中缺少高同源性蛋白。排除未知蛋白和假設蛋白后，數據庫中僅有55 條同源序列的E值＜1.0 e-05。其中，得分最高的為來自蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）的一種PDLIM3（PDZ and LIM domain 3）蛋白，序列一致性僅為38.33%。在同源序列搜索結果中，選取22 條代表性序列構建系統進化樹，結果見圖2。由圖2 可知，厚殼貽貝GRSP 的進化地位較為特殊，其進化支介于扇貝科和牡蠣科且獨立成支，表明在進化上，厚殼貽貝GRSP 與其他雙殼貝類的同源蛋白存在較大差異。

圖3 為厚殼貽貝GRSP 的結構域與來自軟體動物的同源蛋白的結構域比較，由圖3 可知，厚殼貽貝GRSP 序列中無信號肽，含有一個PDZ 結構域和一個ZM 結構域（分別為肽段20～92 和497～522）。進一步比較結構域類似的GRSP 與來自軟體動物的同源蛋白發現，在軟體動物中，含有PDZ 和ZM 結構域的GRSP 同源蛋白，根據其序列長度和結構與分布可分為4 類，其中，第I 類為包括厚殼貽貝GRSP 在內的含PDZ 和ZM 結構域的中等序列同源蛋白（序列長度為500～800 氨基酸殘基）；第II 類為含PDZ，ZM 和LIM 結構域的同源蛋白；第III 類為含PDZ 和ZM 結構域的短序列同源蛋白（序列長度在400 氨基酸殘基內）；第IV 類為含PDZ 和ZM 結構域的長序列同源蛋白（序列長度在1 000 氨基酸殘基以上）。厚殼貽貝GRSP 在序列長度以及結構域架構上與來自蝦夷扇貝（Mizuhopecten yessoensis）的PDLIM3 蛋白，以及來自加州海兔（Aplysia californica）的trithorax 蛋白和pollen-specific leucine-rich repeat extensin-like 蛋白相似，可歸為第I 類。

圖1 厚殼貽貝GRSP 的cDNA 序列與開放閱讀框推導的氨基酸序列比對Fig.1 The molecular sequence of Mytilus coruscus GRSP and the sequential alignment of amino acid sequence derived from its open reading frame

二級結構預測結果表明，厚殼貽貝GRSP 序列中，α-螺旋占18%，β-折疊占8%，且多數分布于序列N 端，少數分布于序列C 端；此外，無規卷曲占78%，為優勢構象，如圖4（a）所示。經SWISS MODEL 服務器通過同源建模方式進一步預測GRSP 的三級結構。在序列比對的基礎上，分別以RCSB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）中得分最高的1v5l.1.A，2uzc.5.A，2q3g.1.A 為模板（3 種模板蛋白均為PDLIM 蛋白），構建結構模型，3 種結構模型基本一致，如圖4（b）所示。厚殼貽貝GRSP 的三級結構主要包括α-螺旋、β-折疊以及無規卷曲，與二級結構預測結果基本一致。

2.2 用密碼子優化策略成功表達重組GRSP

厚殼貽貝GRSP 基因序列長度為1 788 bp，經密碼子優化和序列重新設計后，目標基因序列長度為1 817 bp；目標基因與pET28 表達質粒連接，其重組表達產物的理論分子質量約為80 kD，含目標基因序列和表達質粒的部分載體序列，包括多聚組氨酸標簽。對優化前后的目標基因開展密碼子優化指數（codon adaptation index，CAI）分析，結果見圖5。經OptimumGeneTM 軟件計算，優化前，GRSP 基因的CAI 為0.59；優化后，GRSP 基因的CAI 達0.87，大于0.80，意味著該目標基因在大腸桿菌中的表達效率較高［17］。

2.3 用pET28a/BL21（DE3）體系成功表達重組GRSP

重組GRSP 經IPTG 誘導表達后，以SDSPAGE 驗證表達效果，結果見圖6。表達菌株經IPTG 誘導，出現明顯的目標蛋白條帶，其分子質量約為80 kD，比預期高約10 kD，如圖6（a）所示；采用抗多聚組氨酸標簽的抗體通過western blot進一步分析表達產物，結果表明，目標條帶含有多聚組氨酸標簽，且分子質量也約為80 kD，表明表達產物正確，如圖6（b）所示。在SDS-PAGE 中，由于蛋白質的特殊結構，遷移率出現異常，導致表觀分子質量與其實際分子質量產生差異［18］，又由于GRSP 序列中含有高豐度的谷氨酰胺，且GRSP 是一種堿性蛋白，推測GRSP 在電泳中遷移率偏低，導致分子質量偏大。重組GRSP 的目標條帶，在低溫誘導下表達量極低；而在37 ℃條件下表達量較高，且均在上清和沉淀中表達，但在沉淀中表達量較大，表明重組GRSP 的原核重組表達形式主要為包涵體。重組蛋白的鎳柱分離結果表明，重組蛋白可在300 mmol·L-1咪唑濃度下得到充分洗脫，如圖6（c）所示。

重組GRSP 經鎳柱純化和透析復性后，進一步用反相高效液相色譜進行純化，結果如圖7 所示，收集在45%乙腈濃度時被洗脫的主峰，即為純化的重組GRSP。

2.4 重組GRSP 可誘導碳酸鈣晶體形貌的變化

圖2 采用臨近法繪制的厚殼貽貝GRSP 與22 條代表性同源序列進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of Mytilus coruscus GRSP with 22 homologous sequences using the Neighbor-joining approach

圖3 厚殼貽貝GRSP 的結構域與來自軟體動物的同源蛋白結構域的比較Fig.3 Domain comparison of the Mytilus coruscus GRSP with the homologues from other mollusks

圖4 厚殼貽貝GRSP 的高級結構預測Fig.4 The structural features of Mytilus coruscus GRSP

圖5 優化前后厚殼貽貝GRSP 基因序列的密碼子優化指數分布Fig.5 The CAI distribution of the gene sequence of Mytilus coruscus GRSP before and after the optimization

重組GRSP 對碳酸鈣晶體體外結晶的誘導結果見圖8 和圖9。天然方解石型碳酸鈣晶體形貌為規則的六面體形態，如圖8（a）所示；作為對照組，當牛血清白蛋白（BSA）濃度為50 μg·mL-1時，對方解石型碳酸鈣的結晶無明顯影響，如圖8（b）所示；在低濃度（10 μg·mL-1）和中等濃度（30 μg·mL-1）重組GRSP 誘導下，方解石型碳酸鈣晶體形貌均無明顯變化，如圖8（c）和（d）所示；但在高濃度（50 μg·mL-1）重組GRSP誘導下，部分碳酸鈣晶體出現疊合，如圖8（e）和（f）所示，表明高濃度重組GRSP 對方解石型碳酸鈣的結晶有微弱誘導作用。由圖9（a）和（b）可知，天然文石型碳酸鈣晶體形貌與其在BSA 作用下無明顯區別，均為球狀結構；而在加入不同濃度的重組GRSP 后，文石型碳酸鈣晶體形貌出現了明顯變化。其中，加入低濃度（10 μg·mL-1）重組GRSP 后，部分碳酸鈣晶體發生輕微分裂，如圖9（c）所示；加入30 μg·mL-1重組GRSP 后，大部分碳酸鈣晶體發生較強分裂并出現葡萄狀晶體構造；加入50 μg·mL-1重組GRSP 后，碳酸鈣晶體形貌進一步變為不規則的花瓣狀晶體構造，如圖9（e）和（f）所示。

圖6 重組GRSP 表達后的SDS-PAGE 和western blot 分析Fig.6 SDS-PAGE and western blot analyses of recombinant expressed of GRSP

圖7 重組GRSP 復性后經HPLC 純化和SDS-PAGE 分析Fig.7 HPLC purification and SDS-PAGE analysis of renaturated recombinant GRSP

圖8 方解石型碳酸鈣晶體在不同濃度重組GRSP 誘導下的SEM 結果Fig.8 SEM images of in vitro crystallization of calcite calcium carbonate in the presence of recombinant GRSP with different concentration

圖9 文石型碳酸鈣晶體在不同濃度重組GRSP 誘導下的SEM 結果Fig.9 SEM images of in vitro crystallization of aragonite calcium carbonate in the presence of recombinant GRSP with different concentration

采用傅里葉紅外光譜（FTIR）分析重組GRSP對碳酸鈣晶體晶型的影響，結果見圖10。由圖10（a）可知，重組GRSP（50 μg·mL-1）對方解石型碳酸鈣晶體晶型的影響較明顯，比對照組多2 個峰，即波數為1 087.72 和745.10 的峰，均為文石型碳酸鈣晶體的特征峰［19］；而重組GRSP 對文石型碳酸鈣晶體晶型無明顯影響，見圖10（b）。

2.5 重組GRSP 對方解石型碳酸鈣晶體結晶速度具有抑制作用

圖10 傅里葉紅外光譜分析圖Fig.10 FTIR spectra of the crystals collected from the crystallization experiments

用分光光度計法測定碳酸鈣晶體結晶的時間，記錄在重組GRSP 影響下碳酸鈣晶體結晶速度變化。結果表明，重組GRSP 對方解石型碳酸鈣晶體結晶速度有明顯的抑制作用（P＜0.01），且在高濃度（50 μg·mL-1）條件下抑制作用較強，如圖11（a）所示。但重組GRSP 對文石型碳酸鈣晶體的結晶速度具有一定促進作用，低濃度時表現為輕微促進，高濃度時（50 μg·mL-1）表現為明顯促進（P＜0.05），如圖11（b）所示。

圖11 在重組GRSP 下碳酸鈣晶體結晶速度變化Fig.11 Rate change of CaCO3 crystallization rate by recombinant GRSP

2.6 重組GRSP 具有與碳酸鈣晶體結合的作用

重組GRSP 具有與碳酸鈣晶體結合的作用，由圖12可知，重組GRSP 與方解石型以及文石型碳酸鈣晶體均有明顯的結合作用，經與碳酸鈣晶體孵育并離心，其上清液中蛋白條帶明顯變弱，進一步將已結合重組GRSP的碳酸鈣晶體經醋酸脫鈣，重組GRSP被釋放，在SDS-PAGE電泳中重新出現目標條帶。

圖12 重組GRSP 與方解石型以及文石型碳酸鈣晶體結合后的SDS-PAGE 電泳結果Fig.12 In vitro adsorption of recombinant GRSP precipitated by CaCO3（calcite and aragonite）crystal

3 討論

生物礦化是動物硬組織，包括貝類貝殼（碳酸鈣）和脊椎動物骨骼（羥基磷灰石）等形成的主要機制，其過程受各種生物礦化蛋白的調控［20］。其中，貝類的貝殼基質蛋白在貝殼形成過程中對碳酸鈣晶體有重要的調控作用。從蛋白質組學分析看，從一個物種中鑒定出的貝殼基質蛋白種類有數十種至數百種不等［11，21-23］，這一方面與蛋白質組學鑒定技術及相關儀器的靈敏度有關，另一方面也表明不同物種的貝殼，因其結構差異，在貝殼基質蛋白的分子組成上存在較大差異，同時也表明貝殼在形成時所涉及的分子機理極為復雜。目前，SMP 如何調控貝殼形成仍缺乏足夠的依據，雖然數據庫中已有上千種不同物種的貝殼基質蛋白序列，但其對碳酸鈣晶體結晶的影響以及在貝殼形成中的作用機制仍了解不多。

作為一種含PDZ 結構域的貝殼基質蛋白，GRSP 已在雙殼貝類貝殼，如貽貝、牡蠣、扇貝等中被檢出［11，21，24-25］，表 明GRSP 可能是 一種普 遍存在于雙殼貝類的貝殼基質蛋白。GRSP 無可預測的信號肽，表明該蛋白是一種胞內蛋白，但其通過何種途徑運輸至貝殼內部尚不得而知。但從以往的研究看，在所鑒定的貝殼基質蛋白中，帶有信號肽序列的蛋白所占比例并不高，通常不到20%［11，21］。從現有研究看，貝殼基質蛋白分泌至貝殼具有多種轉運途徑，經典的信號肽轉運途徑只是其中之一，還有囊泡運輸等［26-27］。因此，盡管GRSP 序列中無信號肽，但仍有可能通過其他途徑被轉運至貝殼內。GRSP 的氨基酸序列分析結果表明，GRSP 富含谷氨酰胺、脯氨酸和絲氨酸，其中谷氨酰胺的比例高達18.2%，此外，在序列部分區域形成“QQQP/YQ”重復序列且集中分布在其序列PDZ結構域和ZM 結構域之間（見圖1）。上述低復雜度區域以及高豐度的谷氨酰胺殘基可能與GRSP 的功能密切相關。貝殼基質蛋白通常富含某一種或某幾種氨基酸，例如，從珠母貝（Pinctada fucata）貝殼中檢測到的貝殼基質蛋白N16 富含甘氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺，阿司匹林（Aspein）富含天冬氨酸［28-29］，以及從三角帆蚌（Pinna nobilis）貝殼中檢測到的黏蛋白（mucoperlin）富含絲氨酸和脯氨酸等［30］。高豐度的某種氨基酸往往會在序列中形成所謂的低復雜度區域（low complexity region）或重復片段。該區域因其結構柔性較大，而被認為有利于貝殼基質蛋白的轉運，以及有利于與多種靶標分子（如鈣離子或者碳酸鈣晶體）結合［31-34］；另外，低復雜度區域以及重復片段被認為具備較好的進化靈活性，有利于貝殼基質蛋白的分子進化［35-36］。GRSP 在序列的185～286 肽段以及570～581 肽段，形成富含谷氨酰胺殘基的低復雜度區域（見圖1），推測該區域可能與其分子結構的柔性以及生物礦化功能有重要聯系。

GRSP 序列中含有PDZ 結構域和ZM 結構域，并與PDLIM 蛋白具有一定的同源性。PDZ 結構域普遍存在于生物中，是一種涉及蛋白質-蛋白質相互作用的結構域［37-38］，該結構域參與了多種蛋白質復合物的形成，如膜相關蛋白、胞質信號蛋白、細胞骨架蛋白等［12，37-39］。而ZM 結構域較為短小（不超過30 個氨基酸殘基），且通常伴隨PDZ 結構域出現，主要發現于細胞骨架蛋白和肌肉蛋白中，作為一種Z帶選擇性剪切PDZ 結構域（Z-band alternatively spliced PDZ motif，ZASP）存在［39］。PDLIM 蛋白是一種典型的含PDZ 結構域和ZM 結構域的蛋白，也是一種模塊化的涉及蛋白質相互作用的蛋白質［40］，其在進化過程中具有高度保守性，并在器官發育和維持以及組織形態發生過程中起關鍵作用［41］，PDLIM 蛋白具有多種功能，包括與肌動蛋白的結合，參與細胞骨架調控等［40-43］，此外，其還與生物礦化存在關聯，可調控骨組織發育過程中骨骼的形成、分化和成熟［44］。考慮GRSP 與PDLIM 蛋白存在一定的序列相似性和結構域架構相似性（見圖3），推測GRSP 可能對貝殼的形成有影響，通過蛋白序列中的PDZ/ZM 結構域與其他貝殼基質蛋白的相互作用調控貝殼形成。

重組厚殼貽貝GRSP 的功能分析結果表明，重組GRSP 對碳酸鈣晶體的形貌和晶型影響較大，主要表現為文石型碳酸鈣晶體的形貌發生改變（見圖9）以及方解石型晶體的晶型出現文石型特征峰（見圖10）。厚殼貽貝GRSP 主要鑒定自貝殼中的肌棱柱層［11］。肌棱柱層是貝殼負責與后閉殼肌相連的區域，其碳酸鈣晶體主要為平行排列的文石型晶體，與同樣是文石型的珍珠質層在形貌上差異較大［13，21］。表明同一種晶型的碳酸鈣晶體在貝殼中可構成不同的微觀形貌。推測GRSP 對碳酸鈣晶體的形貌及晶型的影響，與其在肌棱柱層中特別是與文石型晶體在肌棱柱層的形成有關。此外，重組GRSP 對方解石型晶體的結晶速度具有抑制作用，但對文石型晶體的結晶速度有輕微促進作用（見圖11）。貝殼基質蛋白在調控貝殼形成過程中，通常會通過與碳酸鈣晶體的不同晶面結合抑制碳酸鈣晶體結晶［45］，誘導碳酸鈣晶體在不同晶面形成不同的結晶速度，最終形成不同形貌和晶型的碳酸鈣晶體，從而組裝成生物礦化組織的微觀結構［46］。推測GRSP 也是通過類似作用對碳酸鈣晶體的形貌和晶型產生影響，但重組GRSP 對文石型晶體的促進作用仍有待進一步研究。

4 結論

通過密碼子優化結合原核重組表達技術，成功獲得重組厚殼貽貝GRSP 蛋白。通過對該蛋白的序列分析和功能研究發現，作為一種貝殼基質蛋白，厚殼貽貝GRSP 可影響碳酸鈣晶體的形貌和晶型，對碳酸鈣晶體的結晶具有抑制作用，并具有與碳酸鈣晶體結合的能力。該蛋白可能在厚殼貽貝貝殼的肌棱柱層形成過程中發揮重要功能，為探究貽貝貝殼的生物礦化機制以及基于GRSP 的后續研究奠定一定基礎。

感謝浙江大學電鏡中心宋丹丹老師在掃描電鏡觀察中的幫助。