高選擇性過氧化亞硝酰熒光探針的合成及性能研究

后際挺 王冰雅 鄭凌云

摘?要?過氧化亞硝酰（ONOO）是生物體系中重要活性氧之一，對其高效檢測一直備受關注。本研究以4-二乙基氨基水楊醛和6-甲氧基-1-萘滿酮為原料，經一步有機反應，合成了一種帶氧鎓正離子的熒光探針PFP，用于檢測ONOO。通過紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜系統考察了探針PFP對ONOO的光學響應。結果表明，此探針具有選擇性好、靈敏度高（檢出限為15.5 nmol/L）、響應快速（數秒內）、Stokes位移較大（42 nm）、水溶性好等優點。細胞毒性實驗表明，探針PFP具有良好的生物相容性，探針濃度為20 μmol/L時，細胞存活率>95%。激光掃描共聚焦顯微成像結果表明，此探針可用于活細胞中外源性和內源性ONOO的熒光成像研究。

關鍵詞?熒光探針; 活性氧; 過氧化亞硝酰; 細胞成像

1?引 言

作為細胞內活性氧（Reactive oxygen species，ROS）之一，過氧化亞硝酰（ONOO）是由一氧化氮（NO）和超氧根自由基（O·2）以1∶1的化學計量比，通過擴散控制的反應方式生成（k = 0.4×1010～1.9 ×1010 L/（mol s））[1]。由于其強氧化性，ONOO具有抗微生物和抗菌活性[2]; 同時，ONOO在細胞信號傳導過程中起著重要作用[3]。然而，細胞內過度表達的ONOO可引起生物大分子損傷，如DNA和蛋白質的硝化失活[4～6]; 另外，ONOO還可引起線粒體功能失調。近年的研究表明， ONOO參與多種病理生理過程，如心血管疾病、炎癥、癌癥、藥物引起的肝中毒等[7～10]，因此，ONOO被認為是一種疾病診斷的生物標志物[10]。

基于ONOO重要的生理功能，開發可靠有效的ONOO檢測手段具有十分重要的意義。目前，由于其高靈敏性、非侵入性成像、高時空分辨率等優點[11～15]，熒光分析法已成為檢測生物體系中ONOO的最有效手段[16～18]。自2006年Yang等首次報道高選擇性ONOO熒光探針以來[19]，研究者合成了許多不同性能的熒光探針， 用于ONOO的檢測及生物成像研究[20～32]。這些探針與ONOO的作用模式主要有：硫屬化合物的氧化[20，21]、硼酸或硼酸酯的氧化水解[22，23]、肼的氧化水解[24，25]、活性CC雙鍵的氧化裂解[26，27]和N-氧化去芳基化[28，29]。雖然這些探針對ONOO表現出良好的光學響應，且已在生物體系中得到了較為廣泛的應用，但都存在一些問題。例如，硼酸酯或硼酸類探針的水溶性較差并且易受HOCl和H2O2的干擾[18]; 含活性CC雙鍵的探針則易受親核性物質（如SO23）的影響[33，34]。此外，目前報道的大多數ONOO熒光探針的最大發射波長λmax<600 nm，易受細胞內背景熒光信號干擾，不利于活體成像。因此，開發具有良好水溶性、高選擇性及長波發射（λem>600 nm）的熒光探針用于ONOO的生物成像，仍然具有挑戰性。

自2014年以來，本研究組先后以香豆素-吡啶鹽和香豆素-喹啉鹽為探針平臺，通過活性CC雙鍵的氧化裂解途徑，實現了ONOO的熒光檢測[35，36]。該系列探針具有良好的水溶性和選擇性，但其λmax僅約為490 nm，不利于高信噪比熒光成像。最近，本研究組利用吩噻嗪衍生物構建了一個比率熒光探針，與ONOO作用后，λmax可從630 nm藍移至480 nm，然而該探針水溶性較差，需要使用表面活性劑Triton X-100作為助溶劑[37]。

考慮到上述工作的不足，本研究以水楊醛和萘酮為原料，通過一步縮合反應制備了一種檢測ONOO的新型熒光探針PFP。此探針帶有一個正電荷，具有極佳的水溶性; 同時，D-A-D電子結構使此探針在628 nm處具有較強熒光。此探針與ONOO反應后得到無熒光的產物，從而實現對ONOO的長波檢測。此探針被成功用于活細胞中外源性和內源性ONOO的熒光成像，在ONOO生理功能研究方面具有潛在的應用價值。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

JEOL ECZ600R/S3 600 MHz核磁共振儀（日本Jeol Resonance公司，TMS為內標）; Xevo G2-XS QTof質譜儀（美國Waters公司）; UV-3900型分光光度計（日本日立公司）; ?FLS 1000型熒光光譜儀（英國愛丁堡儀器公司）; Leica TCS SP8動態超高分辨單雙光子激光共聚焦聯用系統（德國徠卡公司）。

4-二乙基氨基水楊醛（Ark試劑公司）; 6-甲氧基-1-萘滿酮（安耐吉試劑公司）; 5-氨基-3-（4-嗎啉基）-1，2，3-惡二唑鎓鹽酸鹽（3-Morpholinosydnonimine，SIN-1，阿拉丁試劑公司）; 脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和干擾素（Interferon-γ， IFN-γ）（北京索萊寶科技有限公司）。實驗用水為二次蒸餾水。

2.2?探針PFP的合成

合成路線參照文獻[38]并稍作改動。具體合成路線如圖1所示，將4-二乙基氨基水楊醛（1.93 g，10 mmol）和6-甲氧基-1-萘滿酮（1.76 g， 10 mmol）溶于20 mL濃H2SO4（98%），Ar保護下于90℃反應5 h。反應結束后，冷卻至室溫，然后倒入約200 g冰中。攪拌下緩慢加入HOCl4（70%，10 mL），將所得沉淀抽濾，并先后用大量水和少量丙酮洗滌濾渣。干燥后，得2.8 g深紅色固體PFP，產率為65%。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6） δ （ppm）： 8.58 （s， 1H）， 8.30 （s， 1H）， 7.87 （d， J=9.3 Hz， 1H）， 7.39 （d， J=9.1 Hz， 1H）， 7.32 （s， 1H）， 6.88 （s， 1H）， 3.67 （q， J=6.7 Hz， 4H）， 3.40 （s， 3H）， 2.97 （s， 4H）， 1.20 （t， J=6.9 Hz， 6H）。13C NMR（150 MHz， DMSO-d6） δ （ppm）： 163.47， 159.73， 158.62， 155.75， 148.66， 146.44， 132.32， 131.55， 126.34， 120.94， 118.37， 118.18， 118.03， 117.45， 96.37， 45.89， 26.81， 25.06， 16.76， 12.98。TOF MS： calcd.?for C22H24NO+2 334.1802， found 334.1811。

2.3?ROS溶液配制

O·2：用CaH2預干燥二甲亞砜（DMSO）過夜，然后將其離心（3000 r/min， 20 min），得到無水DMSO后，加入KO2，超聲溶解。

羥基自由基（·OH）：利用FeCl2和過量的H2O2現配現用。

ONOO：將20 mL HCl（0.6 mol/L）和H2O2（0.7 mol/L）的混合溶液與20 mL NaNO2溶液（0.6 mol/L）迅速倒入到冰塊上，1 s內倒入20 mL冷的NaOH溶液（1.2 mol/L）。溶液顏色由無色變為黃色，然后加入30 mg MnO2除去多余的H2O2，密封，置于20℃保存。利用紫外-可見吸收光譜標定其最終濃度（ε302=1670 L/（mol cm））。

H2O2： 將30% H2O2稀釋，通過紫外-可見吸收光譜標定其最終濃度（ε240=43.6 L/（mol·cm））。

ClO： 將5% NaOCl稀釋，通過紫外-可見吸收光譜標定其最終濃度（ε292=350 L/（mol·cm））。

TBHP（tBuOOH）： 將70% TBHP溶液稀釋至最終濃度為20 mmol/L。

2.4?探針PFP的合成

熒光量子產率的測定在PBS溶液中進行。使用羅丹明B（ΦS=0.69，甲醇作為溶劑）作為參比。熒光量子產率通過公式（1）計算：

其中， Φ為熒光量子產率，A為在激發波長處的吸光度; F為激發波長處激發后的積分熒光面積; n是溶劑的折射率; 下標S和X分別代表參比和未知樣品。

2.5?光譜測定

配制探針的DMSO母液（5 mmol/L），在磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2～7.4，10 mmol/L）中進行光譜測試。探針濃度為10 μmol/L，激發波長為568 nm，激發和發射狹縫寬度均為1 nm。選擇性實驗中，所需各種底物濃度均為100 μmol/L。

2.6?細胞成像實驗

外源性：將人乳腺癌細胞（MCF-7）置于37℃、5% CO2的培養箱中培養。在進行熒光成像實驗之前，細胞用PBS清洗3次，然后加入10 μmol/L PFP培養30 min。用PBS清洗3次后，加入100 μmol/L SIN-1繼續培養30 min，用PBS清洗3次后，在激光共聚焦熒光成像儀下成像。

內源性：將MCF-7細胞置于37℃、5% CO2的培養箱中培養。在進行熒光成像實驗之前，在細胞中加入LPS（1 μg/mL）以及IFN-γ（50 ng/mL）培養 24 h。加入10 μmol/L PFP繼續培養30 min后， 細胞用PBS清洗3次，在激光共聚焦熒光成像儀下成像。

成像所用激發波長為559 nm，收光窗口為600～660 nm。

3?結果與討論

3.1?探針的選擇性

考察了探針PFP對活性物質的選擇性。當探針濃度為10 μmol/L時，PFP在PBS緩沖液中溶解性良好，最大吸收波長位于586 nm（ε=29500 L/（mol·cm））。如圖2所示，向探針溶液加入10倍摩爾比常見的細胞內ROS時，包括O·2、·OH、ONOO、H2O2、ClO及TBHP，發現在ONOO存在下，探針在586 nm處的吸收幾乎完全消失; ClO可以引起探針吸收部分減弱，其它ROS則對探針的吸收光譜不產生影響。由于探針分子中存在氧鎓正離子，因此考察了親核性物質（包括S2、SO23、半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH））對探針結構的影響。結果表明，這些親核性物質與探針分子不發生反應。熒光發射光譜（圖2B）顯示，PFP在628 nm具有強烈的熒光發射峰，Stokes位移為42 nm。傳統的長波熒光染料（如花菁、甲基藍）通常具有較短Stokes位移（～20 nm），這導致其用于生物熒光成像實驗時常出現竄光干擾。相比之下，PFP具有更大的Stokes位移，有利于熒光成像應用。類似于吸收光譜中的現象，在ONOO作用下，PFP的熒光完全被猝滅（圖3A）; ?ClO引起探針熒光強度略微增強，而其它活性物質對探針發射光譜的影響很小，可忽略不計。另外，向ONOO及其它物質的混合溶液中加入探針分子，依然可觀察到明顯的熒光猝滅現象（圖3B），說明探針對ONOO的檢測能力基本不受其它物質的影響。綜上，探針對ONOO具有良好的選擇性和抗干擾檢測能力。

3.2?探針對ONOO的識別性能研究

考察了探針的吸收光譜和發射光譜隨ONOO濃度的變化趨勢。如圖4所示，隨著ONOO濃度從0 μmol/L逐漸增加到200 μmol/L，探針在586 nm處的吸收峰逐漸消失，顏色從紫紅色逐漸變為淺紫色。另一方面，探針在628 nm處的熒光強度也逐漸減弱，熒光量子產率從0.13降至0.03。

由圖5A中的熒光滴定曲線可見，在ONOO作用下，探針熒光的猝滅速率由快到慢; 當ONOO濃度高于50 μmol/L時，探針的熒光強度基本不再變化，此時猝滅效率達到98%，說明探針已與ONOO完全反應。如圖5B所示，當ONOO濃度在0.1～5.0 μmol/L之間時，探針在628 nm處的熒光強度與ONOO濃度呈線性關系，線性方程為y=86.5-24.9x（R2=0.999），檢出限（3σ/k， 其中，σ為掃描探針溶液10次得到的熒光強度的標準偏差，k為探針熒光強度與底物濃度呈線性作用區間的斜率）為15.5 nmol/L， 與文獻報道數值相當（表1），說明此探針對ONOO具有較高靈敏度。

3.3?探針對ONOO的細胞成像實驗

將此探針用于活細胞內ONOO的熒光成像研究。利用四唑鹽（3-（4，5）-Dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）比色法，對PFP的細胞毒性進行評價。將不同濃度探針與MCF-7細胞培養24 h后，發現探針濃度達到20 μmol/L時，細胞存活率依然大于95%，表明此探針具有良好的生物相容性（圖7）。

考慮到細胞內pH范圍在4～8之間，為了探究細胞內不同區域pH值對探針熒光是否產生影響，在進行細胞成像實驗之前，測試了探針在pH=4和pH=8條件下的穩定性。如圖7B所示，探針在pH值不同的兩種溶液中持續光照1 h后，其熒光強度基本不變，表明PFP適用于細胞內成像。隨后，檢測了探針對細胞外源性ONOO的熒光成像能力。如圖8所示，將MCF-7細胞與10 μmol/L探針培養30 min后，可觀察到細胞內出現強烈的紅色熒光，且熒光主要分布在細胞核外，說明PFP具有良好的細胞膜滲透性。SIN-1在水溶液中易緩慢分解，在O2存在下生成NO和O·2，進而生成ONOO[40]。將細胞與探針預孵育30 min后，再與SIN-1培養30 min，細胞內紅色熒光明顯減弱，說明SIN-1促進了細胞內ONOO濃度升高，從而導致探針被消耗，熒光消失。

由于ONOO是一種細胞內源性ROS，因此考察了探針對LPS和IFN-γ刺激下細胞內ONOO濃度變化的成像能力。LPS和IFN-γ能夠誘導細胞表達一氧化氮合成酶（NOS2），從而促進細胞內ONOO水平的升高[20]。如圖9所示，將細胞與LPS和IFN-γ孵育24 h后，再與探針培養30 min，紅色熒光幾乎消失，說明探針可以對細胞受刺激下產生的ONOO進行靈敏的熒光成像。

4?結 論

合成了一種帶氧鎓正離子的熒光染料。此染料可發射628 nm強烈紅色熒光，與ONOO反應后， 熒光被猝滅。此探針具有響應快速、選擇性好、靈敏度高、水溶性好、Stokes位移較大、細胞毒性低等優點。可能由于探針與ONOO反應較為復雜，本研究未能成功鑒定氧化產物，反應機制有待深入探究。與熒光增強型探針相比，此探針由于本身具有強熒光，可以直觀地觀察其細胞膜滲透性及細胞內分布等。本研究將此探針成功應用于活細胞中外源性和內源性ONOO的熒光成像研究。此探針在細胞及活體層面上的相關病理生理過程中ONOO的熒光示蹤方面具有潛在的應用價值。

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