基于介孔結構的上轉換分子印跡熒光探針檢測全氟辛烷磺酸

李晶 郭會琴 于慧 田凌溪 顏流水 劉小明 林立鈳 汪嘉琳

摘?要?全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate，PFOS）作為環境中最典型的全氟化合物之一，具有持久性、毒性及在生物體內積累等效應。發展快速、靈敏檢測環境介質中PFOS的分析方法具有重要意義。本研究以PFOS為模板分子，N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺為功能單體，設計合成了具有介孔結構的表面分子印跡熒光探針NH2-UCNPs@MIPs。PFOS可通過F-F與靜電相互作用與NH2-UCNPs@MIPs結合，導致其熒光猝滅，基于此建立了水溶液中PFOS（0.01～15 nmol/L濃度范圍內）的高效識別和高靈敏檢測技術，并實現了在酸性和中性條件下，對環境水樣和人血清基質樣品中痕量PFOS的檢測。本研究為復雜基質中PFOS的快速檢測提供了參考。

關鍵詞?上轉換熒光; 全氟辛烷磺酸; 表面分子印跡; 氟-氟相互作用; 血清

1?引 言

全氟辛烷磺酸 （Perfluorooctane sulfonate，PFOS）是由疏水疏脂的全氟烷基鏈和極性的磺酸基組成，是一種新型的持久性有機污染物[1]。PFOS的獨特結構使其對生物和化學降解具有出色的抵抗能力[2]，一旦排放到環境中，很難被降解。研究表明，即使微量的PFOS也可能對人體肝臟、腎臟造成嚴重的功能損害，對脂肪酸代謝、生殖系統、激素分泌系統產生不良影響[3，4]。由于PFOS在環境中存在的廣泛性以及對生物體的危害，2009年PFOS被列入《斯德哥爾摩公約》，限制其在全球的生產和使用。2016年，美國環境保護署（EPA）設定了飲用水中PFOS終身暴露的健康咨詢水平（Health advisory level，HAL）為70 ng/L[5]。 而我國僅規定飲用水中氟化物含量不得超過1.0 mg/L，尚未制定對單體PFOS的污染控制濃度限制[6]。 然而，在全世界不同地區的地表水環境以及生物樣品中均有PFOS檢出[1]，因此，開發PFOS的檢測分析方法對于監控水質安全及風險暴露途徑具有重要意義。

目前，PFOS常用的檢測技術為色譜-質譜聯用技術[7～10]，但其存在儀器操作復雜、儀器使用和維護成本較高， 以及對操作人員要求較高等問題。研究者不斷探索簡便快速的檢測方法，其中， 熒光法由于具有操作簡便、分析速度快、靈敏度高等優點而備受關注。目前，熒光法檢測PFOS使用的發光材料主要為有機染料[11]和碳點[12]等。稀土上轉換材料具有毒性低、化學穩定性高、光穩定性好、吸收和發射帶窄、壽命長等優點[13，14]，基于其構建的熒光探針已引起廣泛關注。本研究組曾通過在NaYF4∶Yb，Er納米材料表面簡單包覆含氟硅烷化試劑，并基于材料表面與PFOS之間的FF相互作用，構建了對PFOS具有較好響應的熒光探針，但所構建探針仍存在對PFOS檢測靈敏度和選擇性不高等問題[15]。

分子印跡技術（Molecularly imprinting technology，MIT）是一種基于“酶-底物”及“抗體-抗原”相互作用原理的制備技術。將分子印跡技術的良好選擇性與熒光納米材料的優異發光特性結合，可構建高效識別和高靈敏檢測目標物的分子印跡熒光探針。目前，所構建的針對PFOS的熒光探針多基于材料表面功能單體與PFOS之間的靜電作用，多在較強酸性條件下使用[16，17]。研究表明，將氟化烷基硅烷在基質材料上接枝，材料可通過FF相互作用對全氟化合物吸附結合，并可有效應用于樣品前處理，吸附材料在中性條件下表現出與全氟化合物目標物較好的結合效果[18～20]。本研究組在前期研究中發現，基于FF相互作用所構建的PFOS檢測探針在弱酸性到堿性條件下也表現出較好的熒光響應靈敏度[15]。

經二氧化硅包覆后的上轉換熒光納米材料不僅能夠良好地分散在水溶液中， 同時在二氧化硅表面可方便地進行功能化基團修飾，有利于進一步的應用[21，22]。本研究采用氨基修飾的上轉換熒光納米粒子（NH2-UCNPs）作為核心支撐材料和熒光信號源，N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）為功能單體，PFOS為模板分子，正硅酸乙酯（TEOS）為交聯劑，十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）為致孔劑，結合表面分子印跡技術制備了含有介孔SiO2薄層的NH2-UCNPs@MIPs熒光探針，并對此探針檢測PFOS的響應時間、靈敏度、穩定性和選擇性進行了系統考察。將PFOS加入檢測體系時，基于NH2-UCNPs@MIPs與PFOS之間的FF作用與靜電作用導致NH2-UCNPs@MIPs熒光猝滅，根據熒光強度變化可實現對PFOS進行定量檢測，基于此建立了一種高選擇性， 高靈敏， 并可在酸性和中性條件下檢測多種基質中PFOS的熒光分析方法。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

F-7000熒光分光光度計 （日本日立公司）; 高穩定性紅外激光器（長春新產業光電技術有限公司）; JSM-6700F場發射掃描電子顯微鏡SEM、SM-2010透射電子顯微鏡TEM （日本電子公司）; Nicolet is 5型傅里葉變換紅外光譜儀 （美國Thermo Fisher Scientific公司）; Nove 2000e比表面分析儀（美國Quantachrome公司）; 鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）; 數控超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

YCl3·6H2O（99.99%）、YbCl3·6H2O（99.99%）、ErCl3·6H2O（99.99%）、BSTFA（98%）購自麥克林試劑公司; N-（β-氨乙基-γ-氨丙基）甲基二甲氧基硅烷（KH-602，≥98%）、全氟辛烷磺酸鹽（98%）購自阿拉丁試劑公司; 檸檬酸鈉購自上海試四赫維化工有限公司; CTAB和TEOS購自西隴化工股份有限公司。所用試劑均為分析純，無需進一步純化。

2.2?材料制備

2.2.1?NaYF4∶Yb，Er納米粒子的制備及氨基化修飾?參考文獻[23]方法制備上轉換NaYF4∶Yb，Er納米粒子。在磁力攪拌下，將5 mL含1 mmol LnCl3（Ln=Y∶Yb∶Er， 80∶18∶2）溶液與2 mmol檸檬酸鈉加入10 mL水中。將5 mL含2.88 mmol NaCl和6 mmol NH4F的水溶液、10 mL油酸和5 mL乙二醇加至上述溶液，充分攪拌后轉入50 mL反應釜中， 180℃反應6 h。反應結束后，自然冷卻至室溫，傾出混合液，離心分離后，用乙醇洗滌沉淀物， 并于60℃真空干燥12 h，得到上轉換材料NaYF4∶Yb，Er （UCNPs）。

采用反相微乳液法[24]制備氨基修飾的UCNPs粒子（NH2-UCNPS）。將100 mg UCNPs、10 mL環己烷和1 mL IGEPAL CO-520混合并超聲分散，然后向溶液中依次加入4 mL IGEPAL CO-520和800 μL 氨水，磁力攪拌30 min，緩慢滴加200 μL TEOS，攪拌反應12 h。將400 mL KH-602滴加入溶液中，繼續攪拌反應3 h。反應結束后，反應液離心，沉淀物使用乙醇洗滌后，于60℃真空干燥12 h，得到氨基化的上轉換納米材料 NH2-UCNPs。

2.2.2?NH2-UCNPS@MIPs的合成?準確稱取50 mg NH2-UCNPs分散于30 mL去離子水中，超聲分散10 min。加入30 mg PFOS和100 μL N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）進行預組裝。攪拌30 min后，依次加入1.6 mL 0.2 mol/L CTAB和0.2 mL 0.2 mol/L NaOH溶液。繼續攪拌反應30 min后，依次滴加200 μL 氨水和200 μL TEOS，磁力攪拌下反應12 h。反應完成后，將反應液離心，用乙醇-0.1 mol/L HCl （8∶2，V/V）洗脫液將模板分子PFOS和致孔劑CTAB洗脫，然后用去離子水離心洗滌，以去除表面多余的HCl。最后將所得固體粉末置于60℃真空干燥箱中干燥，即得到印跡熒光探針（NH2-UCNPS@MIPs）。非印跡熒光探針NH2-UCNPS@NIPs制備過程除不加入模板分子PFOS外，其它步驟同上。

2.3?NH2-UCNPS@MIPs對PFOS的熒光響應

于10 mL具塞比色管中加入800 μL NH2-UCNPs@MIPs分散液，再加入100 μL BR緩沖液 （pH=2.9）調節體系酸度，混勻，加入不同濃度的PFOS標準溶液，用去離子水定容至10 mL，于室溫下放置10 min。在激發波長980 nm下，測量體系的熒光光譜，根據545 nm處的熒光強度的變化值實現對PFOS的定量檢測。

2.4?樣品預處理

采樣用器皿需預先使用甲醇、去離子水清洗，使用前需用樣品水體清洗3次。水樣采集后靜置，并加熱煮沸，冷卻至室溫后，用0.20 μm濾膜過濾3次，以去除水中雜質，于4℃儲存，并于24 h內完成測定。血清樣品在室溫下以10000 r/min離心10 min，在上清液中添加乙腈（CH3CN∶血清=1∶1，V/V），渦旋2 min，以10000 r/min離心10 min，去除血清中的蛋白。將上清液用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液，于4℃儲存，并于24 h內完成測定。

3?結果與討論

3.1?NH2-UCNPS@MIPs的制備

NH2-UCNPS@MIPs材料制備以及檢測PFOS的原理如圖1所示。通過溶劑熱法制備水分散性和發光性能良好的上轉換粒子NaYF4∶Yb，Er，在其表面包覆一層SiO2，并修飾硅烷化試劑KH-602，得到表面含有豐富氨基基團的UCNPS粒子，即NH2-UCNPS。以NH2-UCNPS為支撐材料和熒光信號源，PFOS為模板分子，BSTFA為功能單體，CTAB為致孔劑，TEOS為交聯劑，在堿性條件下引發NH2-UCNPS表面形成對PFOS具有特異性識別位點的介孔二氧化硅薄層，使用洗脫液去除PFOS和CTAB后，得到介孔分子印跡熒光探針NH2-UCNPs@MIPs。 模板和致孔劑洗脫前，非印跡材料的熒光強度遠高于印跡材料; 洗脫完全后， 非印跡材料的熒光強度保持不變，印跡材料的熒光強度得以恢復，以此可以判斷模板和致孔劑得以完全去除。熒光材料所具有的介孔結構使其具有大的比表面積，增大了對PFOS的吸附量，加快了傳質速率。

3.2?NH2-UCNPS@MIPs表征

3.2.1?NH2-UCNPS@MIPs形貌表征?NH2-UCNPS和NH2-UCNPS@MIPs的形貌通過掃描與透射電鏡進行表征。掃描電鏡圖如圖2A和2B所示，兩種材料均呈扁平六棱柱狀，尺寸分布均勻，分散性較好，平均粒徑為1.5 μm。由透射電鏡圖（圖2C）可知，NH2-UCNPS表面有球狀顆粒覆在表面，這是由于在UCNPS表面包覆SiO2時，部分TEOS水解縮合生成SiO2微球。由NH2-UCNPS@MIPs的TEM圖（圖3D）可以估算出，在NH2-UCNPS表面形成約20 nm的印跡層，超薄的印跡層使得NH2-UCNPS@MIPs具有較低的傳質阻力和較好的吸附容量，同時提供大量印跡位點，實現對PFOS的特異識別。

3.2.2?紅外光譜分析?圖3為NH2-UCNPs（圖3a）、NH2-UCNPs@MIPs（模板洗脫前） （圖3b）、NH2-UCNPs@MIPs（模板洗脫后） （圖3c）和NH2-UCNPs@NIPs（圖3d）的紅外光譜分析結果。由NH2-UCNPs的紅外吸收曲線可知，798 cm1處小峰對應 SiO的對稱伸縮振動峰，1085 cm1處強而寬的峰對應SiOSi反對稱伸縮振動峰，

在1411 cm1處有較弱的CN伸縮振動峰， 3432 cm1處有寬的NH伸縮振動峰，這些結果均表明在UCNPs粒子表面包覆SiO2，并在其表面成功修飾氨基基團。在NH2-UCNPs表面包覆印跡層后，洗脫模板分子和致孔劑之前，在NH2-UCNPs@MIPS（洗脫前）曲線中出現1485 cm1 的CTAB的CH伸縮振動峰，2856和2922 cm1處為亞甲基、甲基的對稱和反對稱伸縮振動峰，表明CTAB被包覆于分子印跡聚合物中。由圖3b可見，在1149和1256 cm1處出現CF的伸縮振動峰，且1234 cm1出現PFOS中磺酸根的SO基團的反對稱伸縮振動，表明PFOS與材料成功結合。比較NH2-UCNPs@MIPs（洗脫前后）紅外光譜圖（圖3b和3c）可知， CTAB與PFOS的特征峰消失，說明已將CTAB與PFOS較好去除，從而形成具有特異性識別PFOS介孔結構的熒光探針。 去除模板和致孔劑后的NH2-UCNPs@MIPs紅外光譜并未表現出與NH2-UCNPs@NIPs的明顯差別。

3.2.3?比表面積與孔徑分布分析?由圖4A可知， NH2-UCNPs@MIPs的N2吸附-脫附等溫曲線為典型的Langmuir Ⅳ型曲線，當P/P0>0.4時，出現一個較寬的滯后環，表明NH2-UCNPs@MIPs表面孔道具有較窄的孔口。此外，NH2-UCNPs@MIPs的比表面積為38.12 m2/g，孔體積為0.033 cm3/g。由圖4B可知，NH2-UCNPs@MIPs的孔徑分布較寬，主要集中在2～50 nm，介孔的平均孔徑為3.8 nm。NH2-UCNPs@MIPs較大的比表面積和適中的孔徑提高了對目標分子PFOS的優異傳遞能力。

3.3?孵化時間、體系pH值及離子強度對檢測的影響

考察了室溫孵化60 min內， 孵化時間對體系熒光強度的影響。由圖5A可知，樣品空白的熒光強度值在60 min內基本保持不變（RSD=1.4%），表明其在水溶液中較好的熒光穩定性。加入PFOS后，體系的熒光強度在前5 min內快速下降，6～8 min內熒光強度降低幅度逐漸減緩，在10 min后趨于穩定，并在1 h內基本保持不變。NH2-UCNPs@MIPs與PFOS的快速結合主要歸因于材料表面較薄的介孔印跡殼層，較高的傳質速率有利于PFOS快速進入孔穴與識別位點結合，導致NH2-UCNPs@MIPs熒光猝滅。

體系pH值對NH2-UCNPs@MIPs與PFOS作用前后體系熒光強度的影響如圖5B所示。在pH 2.8～10.2范圍內， NH2-UCNPs@MIPs的熒光強度保持穩定，而與PFOS結合后表現出明顯的熒光猝滅。當pH值從2.8增加到6.3時，兩者的熒光強度差值緩慢降低，隨著pH值繼續增加到10.2，此差值保持穩定。這可能是由于PFOS在水中有較低的pKa（3.27）[25]，帶負電荷，在酸性條件下，NH2-UCNPs@MIPs表面的氨基發生質子化，通過靜電作用與PFOS相結合，同時，PFOS上的氟原子與探針表面的含氟基團發生FF弱相互作用結合，從而導致電荷在探針和PFOS兩者之間發生轉移，使NH2-UCNPs@MIPs發生強烈的熒光猝滅。隨著溶液pH值增大，雖然NH2-UCNPs@MIPs表面氨基逐漸去質子化而使靜電作用逐漸減弱，但由于FF作用的存在，當pH>6時，PFOS仍可與探針發生相互作用，導致其熒光發生明顯猝滅。文獻[26，27]報道的熒光染料尼羅藍（Nile blue A， NBA）和氮摻雜碳點熒光探針檢測PFOS均只能在酸性條件下進行。本研究構建的熒光探針表現出較好的pH值適用范圍，具有較好的實際應用潛能。

考察溶液離子強度對檢測體系熒光猝滅的影響時發現， 體系的熒光猝滅值在0.1～0.6 mol/L NaCl溶液中十分穩定，因此體系選擇不加入NaCl。根據文獻[16，28]報道，基于靜電相互作用構建的異硫氰酸熒光素酯熒光團的二氧化硅印跡探針（FITC-APTS-SiO2）和健那綠B熒光探針檢測PFOS時，響應信號受離子強度影響較大。本研究制備的熒光探針具有較好的鹽耐受度，說明檢測PFOS過程中FF作用可能占主導作用。

3.4?NH2-UCNPs@MIPs作為熒光探針檢測PFOS

NH2-UCNPs@MIPs的熒光猝滅值與PFOS加入濃度的關系可用Stern-Volmer方程[29]擬合：

其中，F0和F為PFOS不存在和存在時的熒光強度，Cq為PFOS的濃度，Ksv為體系的猝滅常數。將（F0/F）-1定義為猝滅量，NH2-UCNPs@MIPs與NH2-UCNPs@NIPs的Ksv的比值定義為印跡因子（IF），用于評價熒光探針的選擇性。

分別在中性和酸性條件下檢測不同濃度PFOS存在下的體系熒光光譜，并進行Stern-Volmer方程線性擬合，結果見圖6。當PFOS濃度在0.01～15 nmol/L之間時，隨著其濃度增加，體系的熒光猝滅程度均逐漸增強。在溶液中，PFOS導致NH2-UCNPs@MIPs熒光猝滅，可歸因于其高的電負性和CF鍵與其表面的氨基與含氟基團發生的靜電和FF相互作用。由圖6A和6B可知，在pH=7.1時，NH2-UCNPs@MIPs檢測PFOS的IF為1.82。當溶液pH=3.4時，NH2-UCNPs@MIPs與PFOS作用后熒光猝滅程度相對更大（圖6C），線性相關方程為（F0/F）-1= 0.8559CPFOS+ 0.0402 （R2=0.9958）。結合非印跡材料的檢測結果計算得到IF=3.63。以上結果表明，在中性和酸性條件下，所構建的熒光探針均可較好地測定PFOS，且在酸性條件下探針的選擇性更強，兩種條件下方法的檢出限均可達到0.01 nmol/L（S/N=3）。

與目前文獻報道的一些分子印跡熒光探針用于典型全氟化合物PFOS或全氟辛酸（PFOA）的檢測方法比較（表1），本研究構建的熒光探針并主要通過FF相互作用對PFOS進行檢測， pH適用范圍廣，且檢出限低、線性范圍寬，所使用發光材料具有低細胞毒性和高穿透深度，光化學穩定性高，顯示出良好的應用前景。