基于納米孔器件的光響應分子的應用

唐婧 王森 吳吉 梁麗媛 王亮 王德強

摘?要?探索生物大分子和小分子的構象以及它們在外界環境中的響應和作用規律對理解有機質的結構與性能的關系十分重要。納米孔作為新興的第三代單分子基因測序技術， 可以實時監測待測物分子的構象變化過程， 在單分子檢測及核酸和蛋白測序方面展現了良好的應用前景。為了進一步提高檢測的分辨率和精確度，可以采用光電聯合檢測方法，通過引入光響應分子以滿足更高的檢測需求。本文綜述了目前納米孔器件的研究進展以及代表性光響應分子在納米孔檢測系統中的設計與應用，主要介紹了偶氮苯及其衍生物、螺吡喃和二芳基乙烯三類光響應分子分別在生物孔和固態孔中的光響應性能。光調控是一種操作簡捷有效的分子結構監控方式，其與納米孔檢測技術的結合在單分子識別方面的應用潛力對多功能納米器件的設計與應用具有重要的指導意義。

關鍵詞?納米孔; 光調控; 生物傳感器; 光響應分子; 結構反轉; 評述

1?引 言

核酸是生命體的遺傳物質，發揮著傳遞遺傳信息、維持生命體進行正常生命活動的重要作用，充分了解核酸的結構信息和運行機制十分重要。DNA除雙螺旋結構外，還存在其它二級結構，這些結構與某些癌癥和遺傳性疾病關聯，所以相繼出現了一些基于核酸二級結構的靶向治療方法[1]。在活細胞中直接觀察核酸的結構變化以及作用機制十分困難，納米孔檢測技術可以實時監測待測物分子的構象變化過程，具有單分子檢測精度[2]，且檢測范圍廣泛，包括小分子有機物[3]、納米粒子[4]和生物分子聚合物[5]等。目前，按納米孔載體材料不同可將納米孔分為生物納米孔和固態納米孔，生物納米孔通常是由蛋白質在磷脂雙分子層上自組裝成的通道結構，具有孔徑和孔型穩定、可重復性好和信噪比高等優點，但是，由于支撐蛋白孔的磷脂雙層的不穩定，使其使用壽命受到限制; 固態納米孔孔徑和孔型可控，環境耐受性強，易于實現孔表面的功能性組裝及標記與修飾，但可重復性和信噪比不及生物納米孔[6]。為了克服生物納米孔和固態納米孔各自的缺點， 并結合它們的優點，研究者誘導生物納米孔在固態納米孔中自組裝制備雜化納米孔[7]，使其具有高穩定性和可重復性; 另外DNA折紙技術的自組裝特性和納米級精確度也為雜化納米孔的構建指明了方向[8]。

鑒于納米孔自身的特性及納米孔限域空間內電學信號檢測精度對分析結果的影響[9]，采用光電聯合檢測方法可進一步提高檢測靈敏度和精確度。光電聯合檢測方法將光調控與電化學分析相結合，在納米器件表面或待測物分子上修飾光響應分子， 獲得光誘導電信號[10，11]，從而進行待測物分析，或進行物質傳輸等[12]。光調節是一種精確、簡單、可重復， 且光照時間、位置、強度都可調控的方法，有利于控制分子的運動和構象的變化[13]。近年來有很多報道關于光響應分子在納米孔檢測技術中的應用，以完成納米孔自組裝[14]，實現離子選擇性傳輸[15]，控制納米孔開關狀態[16]，或者使待測物分子功能化[17，18]等。通過單一的光學檢測技術實現單分子檢測較為困難，因為目前光學傳感體積無法控制在單分子級別，新型的等離激元納米孔將等離激元和納米孔檢測兩種傳感模式相結合，同時提高了檢測精確度和信噪比[19]。本文將主要介紹偶氮苯及其衍生物[20]、螺吡喃[21]和二芳基乙烯[22]三類不同的光響應分子的光響應機制以及它們在光控納米孔器件中的應用。

2?偶氮苯及其衍生物在光響應體系中的應用

偶氮苯及其衍生物是一種常用的光敏開關，紫外光下呈現為順式構象（cis-azo），切換可見光，則呈現為反式構象（trans-azo），且此過程可逆（圖1）。偶氮苯衍生物可以通過聚酰胺修飾在DNA雙鏈的小凹槽上[23]，平面的trans-azo與DNA堿基對之間通過π-π堆疊作用穩定雙鏈，而cis-azo會使雙鏈DNA解鏈[24，25]。據此，研究者做了很多探索，如光調控生物分子在多通道納米器件上的自組裝[26]，以及適配體探針的修飾，不同光照條件下兩種不同結構的適配體探針與目標物之間的親和力差異有助于闡釋適配體與目標物之間的相互作用，在靶向藥物傳遞和光動力治療中具有廣闊的應用前景[27]。體外控制DNA的解鏈和雜交是DNA納米技術的重要步驟，可通過調節溫度實現，若利用光調控， 則需要使DNA序列功能化，而偶氮苯衍生物可與DNA序列發生非共價作用，憑借平面反式構象穩定DNA雙鏈，在紫外光和可見光的調控下實現DNA雙鏈可逆的解鏈與雜交[28]，在恒定溫度條件下， 可逆地控制DNA納米結構的組裝與拆分，這有望成為光調控DNA納米技術的一種新方法。

環糊精（CD）和葫蘆脲（CB[n]）可作為偶氮苯及其衍生物的主體分子[35，36]。生物系統中離子通道的開關狀態受配體、pH值及電位等因素的影響，對于體外實驗，單分子級別的人為調控對實驗條件要求較高，而在納米孔中引入光響應分子有望實現這一目標，并且在納米陣列中亦有很大的應用潛力。固態納米孔結構穩定，易于進行表面功能化， 以優化性能[37]。 Xie等[38]通過在聚酰亞胺（PI）納米孔表面修飾偶氮苯調控納米孔的開關狀態（圖2），利用偶氮苯與β-環糊精（β-CD）的主客體反應，改變納米孔表面的親疏水性，從而使納米孔在非導電和導電狀態之間切換。該系統不僅具有光響應性，還具有電壓調控性，當非導電納米孔兩側的電壓達到極限值（2.6 V）時，納米孔切換為導電狀態，該模型特有的光響應性和電壓調控性有助于研究和操縱納米約束環境下的水行為。此外，納米孔器件的功能化常受到分子馬達的啟發，如在可見光作用下，細菌視紫紅質質子泵系統將質子從細胞質轉移到細胞外，完成跨膜運輸（圖3A）。Xie等[39]模擬該生物質子泵設計了一個仿生光驅動大通量運輸系統（圖3B），修飾有偶氮苯的PI納米孔經光調控使表面親疏水性發生變化，處于納米孔限域空間的偶氮基團在可見光和紫外光的循環照射下，構象連續反轉，將積累在通道中的分子排出，其疏水性只允許β-CD通過納米孔，所展現的高選擇性在藥物傳遞中有潛在的應用價值。除了將偶氮苯修飾在納米孔表面外，Liu等[40]在PI納米孔內修飾了β-CD，制備了基于主客體系的光調控納米流體二極管（圖4），通過調節pH值實現高精度整流，具有不同表面性質和狀態的納米通道為光敏納米流體器件和藥物傳輸與釋放提供了一個新的納米流體平臺。

此外，視覺感受器視紫紅質中的視網膜成分也具有光響應性，經光線觸發， 11-cis-視網膜將轉化為全trans-視網膜，將光轉化為電信號，在生物離子通道的形成過程中發揮著重要作用[41]。受該通道啟發，Shi等[42]基于氧化石墨烯（GO）和偶氮苯之間的相互作用，設計了人工光敏離子柵門，在含有微小傳導通道的多孔陽極氧化鋁（PAA）膜上修飾azo-DNA， 在紫外光照射下，cis-azo的空間位阻使ssDNA序列趨于伸展， 暴露在外的cis-azo與GO發生π-π堆疊作用，此時覆蓋在PAA膜上的GO阻止了離子傳輸; 而在可見光照射下， 平面trans-azo使ssDNA折疊為雙螺旋結構，trans-azo被包裹在dsDNA內部，表面的GO脫落，離子通道打開（圖5），光調控使該離子柵門具有高效切換離子通道開關狀態的能力，并且生物相容性和通用性良好，在光學傳感器、光電轉換和可控藥物釋放等方面具有很好的應用前景。α-溶血素（α-HL）納米孔是目前最廣泛使用的生物納米通道之一，可檢測多肽的結構[43]，或探索dsDNA堿基的質子化機理[44]等。在光敏DNA（azo-dsDNA）序列的檢測中表現出優異的性能（圖6A），不同的光照條件下，α-HL納米孔可識別azo-dsDNA混合物中兩種不同構象的分子（圖6B）[17]，與cis-azo-dsDNA通過α-HL納米孔時產生的阻塞時間（（0.52±0.01） ms， +80 mV）相比，trans-azo-dsDNA的阻塞時間更長（（807±0.36） ms， +80 mV），這是因為trans-azo對DNA雙鏈的穩定作用導致解鏈需要更長的時間，DNA雙鏈的解鏈動力學不僅可以證實trans-azo對dsDNA的穩定作用，還可以精準獲得azo-dsDNA的結構狀態; 光敏DNA在納米孔中的應用提高了納米孔的分辨率，使得生物傳感器對異構體的識別達到了單分子水平。

氣單胞菌溶素（AeL）是另一種在單堿基檢測中具有高靈敏性的生物納米孔，但是野生型氣單胞菌溶素納米孔（WT-AeL）只能區分2～10個堿基的單鏈寡核苷酸[3，45]，利用陽離子調控機制可檢測30個堿基[46]。AeL納米孔對修飾有偶氮苯的光敏DNA（azo-ssDNA）的檢測具有超高的時空分辨率（圖7）[18]，與α-HL納米孔相似，它可以識別azo-ssDNA混合物中兩種不同構象的分子， trans-azo的空間位阻使azo-ssDNA在孔內的易位速度減慢，產生的阻塞時間約是cis-azo-ssDNA的3.3倍，AeL納米孔可以準確監測每個azo-ssDNA分子的過孔狀態，定量檢測cis/trans混合構型中各自的比例[47]，并且光調控可以實現azo-ssDNA在兩種構象之間的可逆轉換，這有助于加深對azo-ssDNA光轉換特性的理解，納米孔提供的納米界面不僅為單分子器件的應用提供了平臺，也對描述相關光可控生物過程和光燃料器件中的光調控活性、效率和機制具有指導意義。

Fragaceatoxin C（FraC）是一種來自Actinoporins蛋白的毒素，可在富含鞘磷脂受體的細胞表面自組裝為α-螺旋納米通道[48]，內部收縮區僅為1.2 nm，但與α-HL和AeL納米孔不同的是，在高電位下，FraC 納米孔α-螺旋跨膜區的形變允許dsDNA易位[49]。FraC納米孔可調節孔徑，這使其可以識別溶液中單個肽的質量，并且對蛋白質進行實時測序，可用于生物樣品的蛋白質組學表征[50，51]。光響應分子的引入可以指導FraC在脂質雙層膜上的自組裝，Mutter等[14]在FraC（azo-FraC）與鞘磷脂的結合位點附近的不同位置修飾了偶氮苯衍生物，以光作為外部觸發因素，可逆地控制FraC在脂質雙層膜上的聚集，在紫外光照射下， cis-azo指導FraC與鞘磷脂的結合，甚至可以取代鞘磷脂使FraC在細胞膜上形成納米通道; 而在可見光照射下， FraC失活（圖8），這種光激活FraC可作用于多種富含鞘磷脂的真核細胞，在光激活腫瘤治療中具有應用潛力，可控制非活性毒素在照射腫瘤部位局部激活，用白光照射腫瘤周圍的區域使其再次失活，并且光調控納米孔自組裝的能力也為降低納米孔陣列制造的復雜性提供了參考。

3?其它光響應分子的應用

螺吡喃及其衍生物也是廣泛使用的光致變色分子，在紫外光照射下，封閉形態的螺吡喃（SP）轉化為開環形態的花青素（MC），經加熱或可見光照射，MC轉化為SP（圖9）[52]。螺吡喃分子的光異構化過程不僅是簡單的立體異構化，而且還誘導了化學結構和物理性質的改變，與SP相比，MC是π-π共軛的極性更大的兩性離子，由此產生的光磁效應可用于制備光致變色的室溫鐵磁材料[53]，在納米纖維/聚二甲基硅氧烷復合材料應用中，分子顏色的改變使該材料具有機械變色性，可實現定向應力和應變的檢測[54]，以及可逆地調控納米探針的熒光性[55]。螺吡喃及其衍生物在碳納米管（CNTs）中應用廣泛，如制備可光固化的CNTs[56]，或作為偶極開關調控碳納米管的發射響應[57]等。此外，若將手性基團共價連接到螺吡喃上，螺吡喃的光異構化會引起手性信號的變化，將兩種螺吡喃對映體引入谷氨酸超分子凝膠，在紫外光和可見光交替照射下，凝膠中的螺吡喃在兩性離子MC和SP之間轉換，自組裝凝膠也會在螺旋型和纖維型之間可逆變化[58]。螺吡喃在異構化過程中親水性的變化可用于調控納米孔的開關狀態[16]，如圖10所示，螺吡喃經聚乙二醇（PEG） 共價修飾在錐形納米孔表面（PEG-SP），在紫外光照射下，SP轉變為可溶于水的MC，此時PEG鏈采用能量更低的折疊構象，使納米孔打開; 在可見光照射下，不溶于水的SP使PEG趨于伸展，納米孔關閉，光調控賦予了納米孔可逆的門控特性。

二芳基乙烯及其衍生物（DAEs）是另一類光響應分子，DAEs含有兩個芳香基團，通過烯烴鍵相連，經光調控發生開環和閉環的異構化過程，圖11為典型的全氟環戊烯衍生物的光致異構化過程示意圖[59]，其衍生物的光響應性質受開環異構體、取代基的構象、異芳基的共軛長度和乙烯橋的性質等因素的影響[60]。

DAEs是最抗疲勞的光致變色化合物之一[61]，經DAEs功能化的熒光探針可以作為光學納米鏡的生物標記物，不僅可提高光學納米鏡的分辨率，而且不需要任何成像介質添加劑即可實現可逆的光敏調控[62]。除此之外，DAEs可改性石墨烯電極，以提高石墨烯電極的精確度、穩定性和可重復性，且具有可逆的電導和光效應[63]。DAEs常用于可光調控的多孔材料中， 作為氣體儲存和分離的吸附劑，如金屬有機骨架（MOFs），DAEs在MOF內的集成使其具有光響應特性，可實現高效碳捕獲，且光驅動DAEs基元的局部異構化不會引起MOF骨架內的整體改變[60]。Fan等[64]制備了以DAEs為基元的金屬有機骨架（DAE-MOF），首次分離了C2H2/C2H4混合氣體，可見光下DAEs的開環異構化使其可以與C2H2/C2H4發生主客體反應，由于C2H2與DAEs分子之間的主客體相互作用力更強，DAE-MOF可以高選擇性的分離出混合氣體中的C2H2，紫外光下處于閉環結構的DAE-MOF無法分離混合氣體。此外，DAEs也用于生物研究中所需的人工納米結構的改性， Mi等[65]?設計合成了一種可精確控制單重態氧（1O2）生成的光敏系統，1O2在光動力治療的細胞殺傷機制中起著至關重要的作用[66]，該系統中1O2的生成活性可被近紅外光照射遠程激活。如圖12所示，摻雜鑭的上轉換納米顆粒（UCNP）作為納米結構的核，而修飾有卟啉PSs的介孔二氧化硅（MSN）作為殼，在沒有光響應分子DAE時，在980 nm 近紅外光照射下，UCNPs的可見上轉換發光與PSs的寬吸收光譜有很好的重疊，可將能量轉移到PS，從而高效生成1O2; 若將光響應分子DAE放置在靠近PSs的納米孔中，介孔中的DAE處于閉環狀態時會阻止1O2的生成，在808 nm光照射下，DAE轉化為開環結構，打開了生成1O2的通道，而紫外光照時DAE發生結構反轉，實現通道的可逆調控。

4?總 結

本文評述了納米孔單分子檢測技術的發展現狀，包括生物納米孔和固態納米孔在鑒別生物分子構象及動態監測方面的應用; 重點介紹了偶氮苯及其衍生物、螺吡喃和二芳基乙烯這三類具有不同光致響應調控機制的光開關分子在不同核酸結構體系、納米器件與多孔材料中的體系設計與分子調控效應。 聯合光電化學、有機合成及材料加工等技術，可設計出更多性能優異的光響應納米器件，應用于生物醫學與材料領域。目前，還有很多技術問題有待解決，包括一些光響應分子在生物體系中的相容性與穩定性，外加光源與體系的兼容與干擾等。光響應納米系統有望應用于體內診療，而光調控方法與納米孔檢測技術的結合在單分子識別方面的潛力也為納米器件的設計提供了新思路。

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