基于妊娠期糖尿病血糖控制效果對Klotho 基因表達影響的研究*

吳昌志 余星火

（江西省婦幼保健院檢驗科 南昌330006）

妊娠期糖尿病一般是指在妊娠后發(fā)生或妊娠后首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常，是妊娠期常見的并發(fā)癥，世界各地的發(fā)生率為5%～10%[1]。隨著我國經(jīng)濟飛速發(fā)展，人們生活方式發(fā)生改變，二孩政策全面開放，妊娠期糖尿病發(fā)病率明顯升高[2]。妊娠期糖尿病患者常無明顯自覺癥狀，分娩結(jié)束后，多數(shù)患者血糖會恢復(fù)，部分患者產(chǎn)后會發(fā)展為2 型糖尿病。然而妊娠期糖尿病對孕婦及胎兒都可產(chǎn)生不良影響，對母體可導(dǎo)致感染、產(chǎn)程延長、難產(chǎn)、羊水增多、妊高征等，對胎兒可導(dǎo)致巨大胎兒、宮內(nèi)發(fā)育遲緩、死胎、新生兒呼吸窘迫等[3～4]。因此，積極控制妊娠期糖尿病對改善妊娠結(jié)局具有重要意義。Klotho 蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的抗衰老蛋白，參與機體多種生理、病理過程[5]。有研究發(fā)現(xiàn)Klotho 蛋白可參與機體能量代謝過程，我們前期的研究數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)Klotho 蛋白與糖化血紅蛋白呈負相關(guān)，然而Klotho 蛋白與高血糖之間的因果關(guān)系及相關(guān)機制尚無相關(guān)研究。本研究在體內(nèi)外模型中探討了Klotho 蛋白在妊娠期糖尿病高血糖代謝的分子機制，為妊娠期糖尿病預(yù)防與治療提供新的潛在治療靶點。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1 一般資料 本研究招募研究對象103 例，均為2018 年11 月～2019 年10 月在江西省婦幼保健院定期做門診孕期檢查的妊娠人群，年齡22～48 歲，平均年齡（28±6.0）歲；孕婦于孕24～28 周行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），對陽性人群進行相應(yīng)治療，并在孕32～35 周測量所有研究對象的糖化血紅蛋白（HbA1c），依據(jù)糖化血紅蛋白指標控制情況分為血糖控制不達標組（HbA1c＞6.5%）56 例，血糖控制達標組（HbA1c＜6.0%）47 例。所有入組的孕婦均為中低危人群，單胎妊娠，無高血壓、心血管疾病、肝病、腎病史，近期無外傷手術(shù)史；排除急慢性感染、呼吸系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)炎癥疾病史，其他產(chǎn)科并發(fā)癥和合并癥。妊娠期糖尿病診斷標準：采用美國糖尿病協(xié)會推薦的OGTT 試驗，孕婦在孕24～28 周口服75 g 葡萄糖后，分別采集空腹，口服葡萄糖1 h 和2 h 標本進行血糖檢測，3 次血糖值分別達到或超過5.1 mmol/L、10.0 mmol/L、8.5 mmol/L 則判定為妊娠期糖尿病。

1.2 血清Klotho 蛋白水平檢測 采用人α-Klotho和β-Klotho 蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒進行檢測，分別購自欽城生物有限公司、百奧萊博有限公司，操作步驟按照商品試劑盒說明書進行。

1.3 HEK293 細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)基為DMEM（Gibco）加100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素，培養(yǎng)環(huán)境37℃，5%二氧化碳（CO2），高糖組采用終濃度為28 mmol/L 的葡萄糖，低糖組采用終濃度為5.5 mmol/L 的葡萄糖，細胞培養(yǎng)基每隔24 h 換液，培養(yǎng)48 h、72 h、96 h、120 h 收獲細胞。培養(yǎng)操作嚴格無菌操作，避免支原體等微生物感染。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法 （RT-PCR） 檢測α-Klotho 和β-Klotho 信使核糖核酸（mRNA）表達水平獲取細胞經(jīng)核糖核酸（RNA）提取，互補脫氧核糖核酸（cDNA）逆轉(zhuǎn)錄后進行RT-PCR 實驗，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）條件：α-Klotho 和β-Klotho 都采取變性95℃，15 s；退火60℃，15 s；延伸70℃，20 s，循環(huán)35 個；然后72℃，10 min。GAPDH 為內(nèi)參基因，其中α-Klotho 引物GCTCTCAAAGCCCACATACTG （前引物），GCAGCATAACGATAGAGGCC（后引物）；β-klotho引物TTCTGGGGTATTGGGACTGGA（前引物），CCATTCGTGCTGCTGACATTT（后引物）；GAPDH引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT（前引物），GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG3'（后引物）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，非正態(tài)分布變量以四分位間距表示而后進行分析，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠期糖尿病血糖控制達標與不達標組α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比較 血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白表達水平在妊娠期糖尿病血糖控制不達標組明顯低于達標組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組妊娠期糖尿病血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比較（±s）

表1 兩組妊娠期糖尿病血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白水平比較（±s）

注：妊娠期糖尿病不達標組與達標組α-Klotho 蛋白水平相比較，*P＜0.05；妊娠期糖尿病不達標組與達標組β-Klotho 蛋白水平相比較，#P＜0.05；妊娠期糖尿病不達標組與達標組HbA1c 水平相比較，△P＜0.05。

組別 n HbA1c（%） α-Klotho（pg/ml） β-Klotho（pg/ml）不達標組達標組56 47 7.91±0.52△5.04±0.24 469±7.69*604±9.89 99±3.68#169±5.91

2.2 HEK293 細胞在不同血糖水平培養(yǎng)條件下α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表 達 水 平28.0 mmol/L 組各檢測時間點HEK293 細胞α-Klotho 和β-Klotho mRNA 表達水平明顯低于5.5 mmol/L 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同血糖水平培養(yǎng)條件下α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表達水平

3 討論

隨著我國經(jīng)濟高速發(fā)展，人們生活條件改善，以及最近二孩政策放開，妊娠期糖尿病發(fā)病率進入了一段快速增長期[6]。研究發(fā)現(xiàn)，決定妊娠結(jié)局和母兒預(yù)后的因素是整個妊娠期間血糖的控制情況，而非某一時間點的血糖是否達標[7]。血糖動態(tài)監(jiān)測是評估妊娠期血糖管理方案有效性的手段，但不定期的檢測血糖給孕婦生理、精神、經(jīng)濟都帶來了不可小覷的影響，因此，血糖監(jiān)測新標志物的研究十分迫切。之前有研究發(fā)現(xiàn)Klotho 蛋白可參與機體能量代謝過程，妊娠期糖尿病是一組以血糖升高、血糖利用障礙為特征的代謝性疾病，Klotho 蛋白是否與妊娠期糖尿病高血糖相關(guān)及作用機制尚無相關(guān)研究[8]。本研究發(fā)現(xiàn)血清α-Klotho 和β-Klotho 蛋白表達水平在妊娠期糖尿病血糖控制不達標組明顯低于達標組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示Klotho 蛋白參與長期的糖代謝平衡過程，Klotho 蛋白有可能可用于妊娠期糖尿病的治療監(jiān)測。

現(xiàn)研究已經(jīng)證實，高血糖可誘導(dǎo)數(shù)種細胞產(chǎn)生活性氧并在組織蓄積，從而導(dǎo)致組織細胞損傷。其具體機制一方面與活性氧直接損失細胞DNA、碳水化合物和蛋白質(zhì)分子有關(guān)，另一方面可能與活性氧激活細胞應(yīng)激敏感性通路相關(guān)[9～10]。本研究在體外以HEK293 細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高血糖培養(yǎng)48 h、72 h、96 h、120 h 后HEK293 細胞28.0 mmol/L 組α-Klotho mRNA 和β-Klotho mRNA 表達水平明顯低于5.5 mmol/L 組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示高血糖是導(dǎo)致Klotho 表達降低的原因。因此，對妊娠期糖尿病患者嚴格控制血糖可阻止Klotho 基因表達水平降低，進而減少不利于新生兒和妊娠的風險。

綜上所述，妊娠糖尿病的發(fā)病率持續(xù)升高及高血糖對妊娠結(jié)局和母兒預(yù)后均有明確不良影響。將妊娠期血糖控制于正常水平有利于減少不良妊娠結(jié)局發(fā)生，但目前的控制現(xiàn)狀仍有待提升，面對這一嚴峻挑戰(zhàn)，我們應(yīng)在現(xiàn)有指南的基礎(chǔ)上，繼續(xù)挖掘一批新的標志物用于規(guī)范、診斷、監(jiān)測和治療妊娠糖尿病，將患者血糖控制到正常水平，同時不斷加強妊娠期母兒產(chǎn)后遠期隨診工作。