狗尾草葉瘟病病原的分子鑒定及其對14 種殺菌劑的敏感性測定

周鋒，范玉闖，馬亞輝，王金葉，胡明城，張明慧，翟鳳艷，劉鳴韜，張偉麗，楊蕊*

（1.河南科技學院資源與環境學院， 河南 新鄉 453003；2.范縣農業農村局，河南 范縣 457500）

狗尾草（Setaria viridis） 又稱綠狗尾草、谷莠子，為單子葉植物綱禾本科黍亞科狗尾草屬植物，常分布在熱帶和亞熱帶地區[1，2]。狗尾草富含酚類和多糖類物質以及鈣和磷等礦質元素，且具有清熱利濕、解毒等功效，是重要的中藥資源[2～6]；同時，其具有易種植、植株較矮小、生長周期較短、二倍體、基因組較小、抗性基因豐富且較容易轉化等特點，是研究單子葉植物基因功能的重要模式植物[1，7～9]。但是，狗尾草由于常伴生在玉米、大豆等主要農作物田中，因此被列為主要的農田雜草[10]。目前，關于狗尾草病原方面的報道主要集中在鏈格孢屬（Alternaria spp.）、甘蔗平臍蠕孢菌（Bipolaris sacchari）、狗尾草平臍蠕孢（B. setariae）、間隔彎孢（Curvularia intermedia） 和嘴突凸臍蠕孢（Exserohilum rostratum） 等[10]，其他病原菌方面的研究尚未見報道；而且，對已報道的相關病原菌鑒定主要集中在形態學方面，對分子鑒定方面的內容涉及較少。

2019 年9 月作者在河南省新鄉市郊區開展作物病害調研過程中發現，部分玉米田邊生長的狗尾草葉片上存在很多形狀為梭形、長橢圓形或橢圓形且邊緣呈灰白色、中央呈暗褐色的病斑（圖1），該癥狀與水稻葉瘟病比較相似[11]。為了進一步明確該病害的病原，對病原物進行了分離、純化以及rDNA-ITS 的分子鑒定，同時測定了病原菌對14 種殺菌劑的敏感性，以期為該病害的化學防控提供指導。

圖1 狗尾草葉瘟病的田間癥狀Fig.1 Field symptoms of leaf blast of green bristlegrass

1 材料與方法

1.1 試驗材料

狗尾草感病葉片，取自田間已發病的植株上。

試劑有PDA 培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂條20 g，dd H2O 定容至1 L）、2×Taq master mix（北京康為世紀生物科技有限公司） 和DNA Marker 2000 （北京博邁德基因技術有限公司）。

殺菌劑有14 種，分別是96.0%咯菌腈原藥（湖北健源化工有限公司）、97.0%咪鮮胺原藥（湖北康寶泰精細化工有限公司）、95.0%氟啶胺原藥（浙江禾本科技有限公司）、96.2%戊唑醇原藥（江蘇黃海農藥化工有限公司）、97.5%吡唑醚菌酯原藥（湖北康寶泰精細化工有限公司）、95.0%苯醚甲環唑原藥（湖北健源化工有限公司）、96.6%醚菌酯（江蘇耕耘化學有限公司）、98.0%腐霉利原藥（浙江禾益農化有限公司）、95.0%氟吡菌酰胺原藥（湖北康寶泰精細化工有限公司）、96.0%嘧菌酯原藥（江蘇耕耘化學有限公司）、97.0%啶酰菌胺原藥（湖北康寶泰精細化工有限公司）、96.2%菌核凈原藥（浙江溫州農藥廠）、98.1%嘧菌環胺原藥（湖北康寶泰精細化工有限公司） 和98.1%多菌靈原藥（天津津北精細化工有限公司）。制備100 μg/mL 藥劑母液，除96.2%菌核凈原藥用甲醇（分析純） 溶解、98.1%多菌靈原藥用0.1 mmol/L 稀鹽酸溶解外，其他原藥均用丙酮（分析純） 溶解。

儀器設備有SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺（浙江蘇凈凈化設備有限公司）、HVA-85 型全自動高壓蒸汽滅菌器（日本HIRAYAMA 公司）、HP2500G 型智能光照培養箱（金壇市瑞華實驗儀器廠）、BSA124S電子天平〔賽多利斯科學儀器（北京） 有限公司〕、2720 型PCR 擴增儀（美國Applied Biosystems 公司），DYY-7C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）、Tanon3500核酸凝膠成像系統（上海天能科技有限公司） 和CX31-RBSFA 型生物顯微鏡（Olympus Corporation）。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離 病原菌分離采用組織分離法[12]，稍有改動。取表現出明顯癥狀的狗尾草葉片，在無菌條件下，將病健交界處剪成面積2～3 mm2的小塊，分別用5%次氯酸鈉溶液、70%酒精各潤洗1 min，再用無菌水沖洗3 次，在超凈臺內晾干后放到PDA 培養基中央，用封口膜封口，倒置于23 ℃普通光照培養箱中培養。15 d 后挑選培養基上的孢子，在生物顯微鏡下鏡檢。其分生孢子為無色或淡褐色，洋梨形，頂部細胞立錐狀，基部細胞鈍圓，有凸起的腳胞，一般為2 個隔膜。

1.2.2 病原菌rDNA-ITS 的分子鑒定 采用羅中欽等[13]方法制備模板DNA，以ITS1 （TCCGTAGGTGAACCTGCGG） /ITS4 （TCCTCCGCTTATTGATATGC） 為 引 物〔由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成〕，對病原菌rDNA-ITS 進行PCR 擴增。50 μL PCR 反應體系包括：2×ES taq master mix 25 μg/mL，引物Ⅰ2 μg/mL，引物Ⅱ2 μg/mL，模板5 μg/mL，dd H2O 16 μg/mL。PCR 反應程序為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min （循環30 次），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，備用。對PCR 產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。并對檢測后有明顯條帶的PCR產物送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進行雙向測序，再用DNAMAN 軟件對測序反饋回來的序列進行初步分析，并將其與GeneBank 中下載的相關序列進行比對分析。

1.2.3 殺菌劑室內毒力測定 殺菌劑室內毒力測定參照室內生長速率法[14]，有改動。在潔凈的工作臺上用無菌水稀釋母液，配制成含不同濃度藥液的PDA 培養基平板，其中，將多菌靈母液分別稀釋成0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 和12.8 μg/mL 的溶液，其他藥劑母液均分別稀釋成0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 和0.8 μg/mL 的溶液，以加無菌水處理作為對照。在每個平板中央接入1 個直徑6 mm的新鮮菌餅，每處理均設3 次重復。在23 ℃培養箱內培養48 h，采用十字交叉法測量菌落直徑，取其平均值。計算生長抑制率和EC50，得到毒力回歸方程。

1.3 數據處理與分析

采用DPS 軟件（專業版） 對試驗數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌rDNA-ITS 序列擴增與序列分析

對狗尾草葉瘟病菌的rDNA-ITS 序列進行PCR 擴增，然后將擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，得到了1 條明亮的條帶（圖2），測序得到長度為513 bp的DNA 片段。在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對，該序列與已報到菌株Pyricularia oryzae （ID：JF414840.1）的序列高度相似，序列相似性為99.00%，鑒定該菌株屬無性真菌類梨孢屬成員。

2.2 殺菌劑對病原菌的室內毒力

圖2 狗尾草葉瘟病菌rDNA-ITS 序列擴增產物凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of leaf blast pathogen of green bristlegrass

供試14 種殺菌劑中，多菌靈的EC50最高，為3.219 6 μg/mL （表1），說明狗尾草葉瘟病菌已經對多菌靈產生了較低水平的抗藥性，用常規劑量已不能完全防除狗尾草葉瘟病的為害；其他13 種殺菌劑對狗尾草葉瘟病菌均具有較高活性，EC50為0.006 7～0.655 9 μg/mL，抑菌活性順序為嘧菌環胺＞咯菌腈＞咪鮮胺＞氟碇胺＞戊唑醇＞吡唑醚菌酯＞苯醚甲環唑＞醚菌酯＞腐霉利＞氟吡菌酰胺＞嘧菌酯＞啶酰菌胺＞菌核凈，表明這13 種殺菌劑均可以作為化學防治狗尾草葉瘟病病菌的候選藥劑，其中嘧菌環胺的抑菌活性最高、菌核凈的相對抑菌活性較弱。

3 結論與討論

通過分子生物學技術對分離到的狗尾草葉瘟病菌進行了rDNA-ITS 分子鑒定，結果表明，病原菌為P.grisea，該結果與水稻稻瘟病的無性病原[11]一致。盡管狗尾草在田間一般作為農田雜草，但是由于該病原菌也可以為害包括水稻在內的作物而引起作物葉瘟病的發生，且該病原可以在病殘體上越冬，所以該病害一旦發生，也同樣需要控制，否則將會為來年初侵染積累充足菌源，造成作物葉瘟病的大面積流行。

表1 14 種殺菌劑對狗尾草葉瘟病菌的室內毒力Table 1 Laboratory virulence of 14 fungicides against P. oryzae

目前，關于狗尾草葉瘟病的化學防治尚未見報道，僅有草坪葉瘟病化學藥劑田間防效的報道[15]，且關于狗尾草葉瘟病化學防治藥劑篩選方面的研究亦尚未見報道。測定該病原菌對殺菌劑的敏感性，進而篩選出對其具有較高活性的殺菌劑，并將其應用于對狗尾草葉瘟病的防控已十分迫切。本研究通過室內分離得到了狗尾草葉瘟病菌株，并通過菌絲生長速率法測定了14 種殺菌劑對狗尾草葉瘟病的毒力，結果顯示，狗尾草葉瘟病除對苯并咪唑類殺菌劑多菌靈已產生較低水平的抗藥性（EC50為3.219 6μg/mL） 外，對其他13 種殺菌劑均具有較高的敏感性，EC50為0.006 7～0.655 9 μg/mL。這13 種殺菌劑均可以作為化學防治狗尾草葉瘟病的候選藥劑，但需要通過田間藥效試驗來進行驗證，并進一步明確其施用方式和使用劑量。