SARS- CoV- 2的生物學性狀和病毒檢測方法以及COVID- 19的治療現狀

張瑞，吳國球,2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫院 檢驗科，江蘇 南京 210009)

由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的2019新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)大流行，截止至2020年6月15日，確診病例已達700多萬人，在全球造成至少430 241 人死亡(https://covid19.who.int/)。SARS-CoV-2屬冠狀病毒科，可引起呼吸系統和神經系統疾病[1]。迄今為止，共鑒定出6種人冠狀病毒，分別為人冠狀病毒229E型(HCoV-229E)、人冠狀病毒HKU1型(HCoV-HKU1)、人冠狀病毒OC43型(HCoV-OC43)、人冠狀病毒NL63型(HCoV-NL63)、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)[2]。SARS-CoV-2有約30 kb的單鏈正鏈RNA基因組，屬冠狀病毒科，可引起呼吸系統和神經系統疾病[1]，被推斷源于蝙蝠，通過人畜共患傳播給人類[3- 4]。傳染源主要是SARS-CoV-2感染患者，包括無癥狀感染者，以呼吸道飛沫和接觸傳播為主要傳播途徑，傳播迅速[5]。早期的實驗室檢測是確保患者盡早收治、及時管控，阻止疫情發展的關鍵環節。目前正在使用抗病毒、抗炎藥物治療這種疾病，尚無針對SARS-CoV-2 感染患者的特定治療方法。在此背景下，作者綜述了SARS-CoV-2的基本生物學特性，檢測技術的基本原理、技術特點，診斷，潛在治療靶點和最新治療藥物研究信息，為臨床醫生及科研工作者提供更好的防治參考和研究思路。

1 SARS-CoV-2的生物學特性

我國科學家將武漢一些不明原因肺炎患者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)接種到人氣道上皮細胞中進行培養分離,通過透射電鏡進行分析，發現含有遺傳物質，直徑60～140 nm，包膜上有獨特的蛋白尖刺的病毒顆粒[6]，其整體結構與冠狀病毒科一致。

SARS-CoV-2是基因組長約30 kb的正單鏈RNA病毒，其基因組具有典型的冠狀病毒結構，包括兩端非翻譯區(untranslated regions, UTR)和編碼27種蛋白質的開放閱讀框區(open reading frame, ORF)。對比多種冠狀病毒序列發現，ORF的非結構蛋白編碼區的序列較為保守，而結構蛋白編碼區序列為適應環境而具有多樣性[7]。SARS-CoV-2與穿山甲(Manis javanica)和蝙蝠CoV RaTG13的冠狀病毒有74%～99%的一致性[6,8- 11]。最近的報道表明，SARS-CoV-2是一種源自蝙蝠的改良冠狀病毒[10,12]，通過人畜傳播進入人類[3- 4]。

SARS-CoV-2主要有4個結構蛋白，分別為刺突蛋白(spike surface protein, S蛋白)、小包膜蛋白(small envelope protein, E蛋白)、基質蛋白(matrix protein, M蛋白)和核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N蛋白)。S蛋白介導病毒識別宿主細胞受體，促進膜融合，并誘導免疫反應產生中和抗體，其中S蛋白的受體結合域(receptoR-binding domain，RBM)能直接與血管緊張素酶2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)受體結合，隨后跨膜絲氨酸蛋白酶裂解ACE2以激活病毒進入，從而感染人類、小鼠、蝙蝠和豬[13- 15]。ACE2在肺中高表達，使肺組織對SARS-CoV-2感染高度敏感[16]。E蛋白和M蛋白均參與病毒顆粒的組裝和釋放[17- 18]。N蛋白序列保守程度高，在病毒復制過程中發揮重要作用，能刺激機體產生高親和力的抗體，但是一般沒有中和活性[19]。

2 流行病學和臨床表現

SARS-CoV-2潛伏期為1～14 d，多為3～7 d，平均6.4 d。SARS-CoV-2確診病例的主要表現為發熱、咳嗽、乏力，少數病例伴有流涕、咽痛和腹瀉等癥狀[20]。發病早期白細胞總數正常或降低，淋巴細胞計數正常或減少。SARS-CoV-2感染患者的嗜中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)是疾病嚴重的早期預警指標[21]。重癥患者主要是老年人[22]，多在發病1周后出現呼吸困難和(或)低氧血癥，可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克及多器官功能衰竭等[20,22]。重型、危重型病例病程中可表現為中低熱,甚至無明顯發熱，而輕型患者僅表現為低熱、輕微乏力等，無肺炎表現[20]。從目前收治的病例情況看，多數患者預后良好，少數患者病情危重。老年人和有慢性基礎疾病者預后較差。目前，已知SARS-CoV-2主要經呼吸道飛沫和接觸途徑傳播，傳染源主要是SARS-CoV-2感染患者[5]。因此，有效的篩查和早期診斷對于控制和治療COVID-19尤為重要。

3 核酸檢測

病毒核酸檢測作為 SARS-CoV-2感染確診標準，具有靈敏度高、特異度好、可早期診斷等優點[23]，主要用于檢測人體是否攜帶病毒，能檢測處于窗口期的患者，適用于早期確診，以盡快找出可能處于潛伏期的無癥狀感染者，減少病毒的進一步擴散。另一方面，核酸檢測可以定量檢測病毒的拷貝數，進而動態監測病毒感染的程度和治療的效果。常用的核酸檢測方法有測序法、實時熒光反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)法、恒溫擴增法、雜交捕獲免疫熒光法和RNA捕獲探針法，熒光定量PCR法是目前臨床上廣泛應用于SARS-CoV-2核酸檢測的方法。

3.1 基因測序技術

分子診斷技術可以準確識別未知的病原體，也為后續SARS-CoV-2核酸檢測提供了特異性基因組序列信息。截至2020年3月24日，SARS-CoV-2的基因組和蛋白質組組成已經確定。我國科學家通過宏基因組測序測定了從患者體內分離出的SARS-CoV-2序列，并向世界衛生組織公開[5,24]。Chen 等[11]提倡使用低輸入元基因組下一代測序(mNGS)方法對從BALF中提取的所有核酸組分進行完全無偏倚的擴增，得出標本中包含的病原微生物相關序列信息，對標本中核酸片段進行測序、生物信息分析和比對，并迅速鑒定出樣本中唯一含量極高的病原體。最近Di等[25]開發了一種基于細菌Tn5轉座酶快速建立RNA測序的轉錄組分析(RNA-seq)文庫的新方法，該方法隨機結合RNA/DNA異質雙鏈，并在逆轉錄后直接將測序適配器添加到RNA上，不需要進行第2鏈互補DNA (cDNA)合成，可檢測到單個細胞的RNA，提升SARS-CoV-2等樣本的測序質量和速度。但是基因測序因存在儀器設備要求較高、費用昂貴、操作復雜、需專業技術人員分析等不足，不適用于臨床常規檢測工作。

3.2 定量RT-PCR法

定量RT-PCR方法檢測SARS-CoV-2核酸是最有效的且廣泛應用于臨床的早期病原學診斷方式，其檢測基本原理是先將特定區域的RNA(以SARS-CoV-2病毒RNA的ORF 1ab、N基因為主)逆轉錄成cDNA，再通過熒光探針對cDNA特定片段進行PCR反應產物實時監測，根據擴增曲線得出起始RNA模板量。定量RT-PCR方法檢測有以下3個重要步驟：(1) RNA提取，注意細胞內源性和外源性RNA的降解；(2) 特異性引物和探針的設計合成，是開發熒光PCR檢測試劑盒的基礎；(3) 反應條件的優化，一般在引物設計軟件推薦溫度上下2 ℃變化尋找最佳引物退火溫度，還需尋找合適的引物、模板和Mg2+濃度。目前已上市的 SARS-CoV-2核酸熒光PCR法檢測試劑盒檢測靶標主要分為病毒基因組中ORF 1ab、N蛋白和E蛋白3個特異性區域。國家藥品監督管理局已應急批準8種SARS-CoV-2熒光PCR法檢測試劑盒，大多數以ORF 1ab+N雙基因作為擴增靶標。

3.3 等溫擴增法

環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術是一種利用特異引物和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下進行的特異、高效、快速的DNA擴增技術[26- 27]，在等溫核酸擴增技術中應用最為廣泛，不需要專門的實驗室設備來進行PCR分析[28]。一些學術實驗室已經開發了一種將LAMP和反轉錄相結合的逆轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)試驗，在30 min內實現了對SARS-CoV-2的檢測。科學家們首先根據NCBI 上發表的SARS-CoV-2的ORF 1ab、S和N基因的保守序列為靶點設計了4套LAMP引物，每套6個引物，分別是正向引物F3、反向引物B3、正向內引物FIP、反向內引物BIP、正向環引物Loop F和反向環引物Loop B，其中兩個Loop引物用來加速LAMP反應，縮短一半原反應的時間[29]，再利用恒溫快速核酸擴增技術，在恒溫條件下呈指數級別放大核酸分子特性，將病毒核酸分子在30 min內放大109～1010倍，最后將擴增放大的核酸分子與染料結合，通過肉眼觀察顏色變化或濁度來判定樣本中是否含有目標SARS-CoV-2分子[30- 32]。RT- LAMP法檢測與常規RT-PCR方法相比結果一致，且無需核酸提取，所需儀器大大簡化(水浴鍋或金屬浴)，反應時間大大縮短，可用于COVID-19的早期診斷，適用于在公共領域和醫院進行大規模篩查。

3.4 雜交捕獲免疫熒光法

雜交捕獲免疫熒光法可快速檢測病原體核酸，無需核酸提取純化、無需PCR擴增，通過處理液直接裂解咽拭子或痰液標本中病原體并釋放靶核酸，靶核酸和探針形成DNA/RNA雜交體，熒光粒子對DNA/RNA雜交體進行熒光信號識別，實現對樣本中目標核酸的定性判斷。目前，國家藥品監督管理局僅審批廈門生物科技有限公司的一個雜交捕獲免疫熒光法檢測SARS-CoV-2核酸的方法。該方法與55種常見病原微生物及其他冠狀病毒不存在交叉反應，且常見病毒治療藥物檢測結果沒影響，完成的670例臨床試驗的靈敏度為88.61%，特異度為94.92%，總體符合率為92.69%，應用前景十分樂觀。

3.5 RNA捕獲探針法

國家藥品監督管理局審批了唯一一個RNA捕獲探針法檢測SARS-CoV-2核酸的試劑盒。其原理是采用RNA特異靶標捕獲和轉錄介導的恒溫擴增實時檢測技術，在一個反應管中自動化完成核酸提取、擴增步驟，90 min 可出結果，并可實現連續并行檢測，檢測結果靈敏度、特異度能夠達到傳統PCR方法的水平。

目前，基于患者咽拭子等標本的病毒核酸檢測是臨床診斷SARS-CoV-2的常用方法，盡管在SARS-CoV-2流行之初該方法在確定患者的SARS-CoV-2感染方面發揮了至關重要的作用，但在臨床應用中遇到了一些質疑。最近的標本量為4 880份的研究中發現，RT-PCR陽性檢出率僅為38%，有大量假陰性病例[33]。當前SARS-CoV-2核酸檢測假陰性的可能原因：(1) 人體內的病毒量還未達到可檢測到的程度；(2) 從鼻腔向下到呼吸道細胞的感染和復制能力逐漸變弱[34]，鼻、咽拭子是最常用的采樣方式，可能會出現未采集或沒采集足夠量的上皮細胞；(3) SARS-CoV-2屬于 RNA 病毒，很不穩定，容易產生變異，且保存、運輸、處理標本不當還會導致核酸降解；(4) 現階段的SARS-CoV-2核酸檢測試劑均為應急性審批，檢測試劑盒靈敏度不夠，需進一步臨床驗證后優化。

4 抗體檢測

SARS-CoV-2感染3～5 d血清特異性抗體逐漸產生，最早出現的是IgM抗體，但該抗體維持時間短、濃度低、親和力較低，在血中持續數日至數周，是急性期感染的診斷指標；然后出現IgG抗體，且在IgM接近消失時IgG的含量達到高峰，它濃度高、維持時間長、親和力高，血清IgG陽性提示感染中后期或既往感染[35]。通過檢測患者血清中IgM和IgG的陽性情況，可有助于臨床醫生判斷患者所處病毒感染的不同時期。據報道，SARS-CoV-2感染后3～6 d血液中可檢測到IgM抗體，8 d血液中可檢測到IgG抗體[36- 37]，此后IgG抗體會一直保留[38]。抗體檢測常用的方法有酶聯免疫吸附法(ELISA)、膠體金法、化學發光法等，3種方法均可測定IgM/ IgG總抗體或分別檢測IgM和IgG抗體兩類，但ELISA的檢測速度慢、步驟繁瑣，還易污染，目前臨床使用較少。目前已獲得國家藥品監督管理局批準的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測試劑盒主要基于膠體金法。

4.1 膠體金法

膠體金免疫層析技術是以硝酸纖維素膜為固相載體，膠體金為標記物，通過抗原抗體特異性反應建立起來的一種新型診斷技術。膠體金法檢測SARS-CoV-2原理是與鼠抗人 IgM/ IgG抗體偶聯的膠體金涂于膠體金墊上，硝酸纖維素膜上固定特異的SARS-CoV-2抗原。陽性樣品滴加到樣品墊后，由于毛細作用向前移動，并與膠體金墊上的復合物結合，當其移動到檢測線處時，與檢測線上包被的特異性抗原結合，使得流動相在檢測線處聚集引發膠體金顯影反應，為紅色反應線。膠體金法檢測SARS-CoV-2無需特殊處理標本，僅需約10 μl的血標本，10～15 min免疫反應后便可肉眼觀測結果。該方法突破了現有測序技術對人員、場所的限制，縮短檢測時間，操作快速方便，廣泛應用于基礎醫療單位及現場檢測。目前已有多家生物公司研發出檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的膠體金試劑，這為SARS-CoV-2感染的輔助診斷和流行病學調查提供了一個極好的檢測手段。

4.2 化學發光技術

化學發光法是利用納米磁珠標記病毒的重組蛋白捕獲血液樣本中的病毒抗體IgM或者IgG，利用與吖啶酯偶聯的二抗識別抗體，加入激發液后通過相對發光強度測定化學發光反應。化學發光免疫分析技術具有靈敏度高、線性范圍寬、檢測速度快、試劑無放射性污染等特點，一直廣泛應用于臨床樣本的檢測。 目前國內已有深圳博奧賽斯等多家公司研發出了化學發光試劑盒用于檢測SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體，而廈門萬泰凱瑞公司開發了首個獲批的雙抗原夾心法總抗體檢測試劑，可實現自動化批量檢測，但依賴于配套化學發光儀器。

抗體檢測試劑盒的陽性預判值的設定存在一定誤差，影響檢測靈敏度、特異度，從而導致一定數量的誤判。產生假陽性的因素：(1) 試劑盒中抗原與SARS-CoV-2或其他亞屬冠狀病毒有交叉反應[37]；(2) 患者自身有某些基礎疾病而長期服用某種藥物或免疫功能異常，標本中存在自身抗體、嗜異性抗體、類風濕因子、非特異IgM等[15]，具有一定的吸附性，影響免疫測定；(3) 標本溶血使血紅蛋白高濃度，在膠體金法的檢測區堆積形成非特異性條帶，干擾目視法判定結果；(4) 細 菌污染,其中的疏水性的菌體碎片與金標粒子或捕捉抗體發生結合，影響判讀。產生假陰性的因素：(1) 無論是IgM 還是IgG，從病毒感染到抗體產生均存在窗口期，因此，在潛伏期和感染初期特異性抗體還沒有產生或者產生量少，低于檢測下限而不能檢出；(2) 病毒變異導致抗體決定簇改變，現有檢測所用病毒抗原無法與之結合。

研究發現，雖然IgG的血清陽性率最高，但有的人僅IgM或IgG陽性[36,39]，因此，應用過程中測定總抗體濃度可顯著提高靈敏度[40]。對于現有抗體檢測試劑來說，90%以上的特異性完全可以滿足臨床使用，但是在我國人群總體流行率很低的情況下，由于抗體檢測“假陽性”和“假陰性”的局限性，不適合用于復工復產復學等一般人群篩查，也不適用于在流行率低地區的流行病學調查。

5 胸部影像學檢查

鑒于SARS-CoV-2核酸檢測技術受感染病程、病毒載量和標本采集等因素影響，易產生假陰性結果，而影像學檢查在SARS-CoV-2早期診斷、疾病分期分級、治療指導、療效評價及動態觀察中均有重要價值，是當前篩查與輔助診斷SARS-CoV-2的主要便捷手段之一。胸部 X 線片檢查肺部早期病變的患者漏診率較高，以高分辨率CT(HRCT)檢查為主要的SARS-CoV-2篩查和輔助診斷手段。根據肺部 CT 影像表現不同判斷病毒感染的早期、進展期、重癥期[41]。病變早期主要表現為多發小結節狀和間質改變[41- 42];進展期病灶逐漸融合，范圍增大，境界不清，累及雙肺多個肺葉、肺段，胸部CT圖像表現為雙側多發毛玻璃樣滲出影和伴有實變、間質水腫而增厚[41- 44]。重癥期患者的CT表現為雙肺彌漫性病灶，大范圍實變，支氣管充氣征常見，呈“白肺”[41,43]。

目前SARS-CoV-2確診主要依靠病毒核酸檢測，但核酸檢測存在采樣不合格導致的漏診、對檢測條件要求較高及檢測流程時間長等不足[45]。與核酸檢測相比，抗體檢測標本易采集且質量有保證、檢測簡單快捷、準確、容易實現高通量、成本低等優點，但其檢測往往滯后于核酸檢測，在檢測靈敏度上也低于核酸檢測，是對SARS-CoV-2核酸檢測假陰性有效互補的檢測指標[46]，也用于與核酸檢測協同使用對疑似病例診斷。動態檢測IgM和IgG變化過程，更能對SARS-CoV-2感染的肺炎進行輔助診斷和反映疾病進程[47]。CT檢查只有在肺部已經產生炎癥反應、組織器官發生器質性病變的情況下才能在影像學上呈現異常，具有一定的滯后性。因此，SARS-CoV-2的診斷應結合臨床特征、胸部影像學、核酸檢測和抗體檢測確定。

6 SARS-CoV-2的治療

SARS-CoV-2 感染患者沒有特定的治療方法，危重病人的病死率高達60%，開發新的降低疾病嚴重程度和病例死亡率的藥物和疫苗是重中之重。由于SARS-CoV-2與ACE2的結合依賴于與絲氨酸蛋白酶的相互作用和S蛋白的裂解，基于ACE2阻滯劑和絲氨酸蛋白酶特異性抑制劑或刺突蛋白的疫苗可能是治療SARS-CoV-2感染的潛在方法[48- 49]；CR3022、GSK1838705A、KT203、KT185、BMS195614等分子與病毒S蛋白的RBD具有較強的親和力，這些分子可以通過與病毒結合來幫助控制快速感染，成為新型抗SARS-CoV-2 的藥物[50- 51]。目前，包括中國在內的多個國家已成功分離出 SARS-CoV-2 毒株并進行疫苗的研發，包括重組疫苗、mRNA疫苗、腺病毒載體疫苗等[52]。Zheng等[53]通過調研大量文獻發現，細胞因子風暴被認為是SARS-CoV-2導致嚴重疾病和死亡的主要原因，而細胞因子產生的原因可能與抗體依賴性增強(antibody-dependent enhancement，ADE)相關的交叉反應性抗體有關。事實證明，中老年人的抗體濃度高于年輕人，而中老年人等容易發展成為重癥，死亡率也更高[21,38,40]。由于ADE的特性開發SARS-CoV-2疫苗將更加困難。研究發現雷帕霉素(rapamycin, mTOR)抑制劑能夠選擇性地抑制SARS-CoV-2早期高危患者記憶B細胞的激活，減少病毒交叉反應抗體的產生，規避ADE效應，降低SARS-CoV-2的嚴重程度。最新研究也支持mTOR抑制劑治療SARS-CoV-2的潛力[54- 55]。

7 展 望

面對SARS-CoV-2大流行，我們成功分離出病毒，并開發了多種核酸檢測和抗體檢測方法，為疾病的診斷和治療提供了實驗室依據，也為疫苗的研發開啟了大門。鑒于目前檢測試劑盒多為國家緊急審批的，未進行臨床驗證，進一步提高現有SARS-CoV-2檢測技術的靈敏度和準確性、開發新型特異檢測方法成為主要的研究方向。SARS-CoV-2全球大流行，在全世界范圍內產生對藥物和疫苗的迫切需求。目前尚未明確特定的手段治療COVID-19，需要繼續研發針對不同程度、不同癥狀患者的治療藥物。