莪術油超聲提取工藝優化及生物活性研究*

趙海燕，許 鈺，班穎芳，張義浩，蔡吉祥

(1 廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西 來賓 546119；2 廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室，廣西 來賓 546119)

廣西莪術也稱桂莪術，為廣西莪術(CurcumakwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang)的干燥根莖，是廣西的道地藥材，其有行氣破血、消積止痛的功效[1-2]。近年來研究發現莪術油具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌、消炎等多種生物活性[3]。現階段揮發油提取方法有水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法、索氏提取法等[4-6]。超聲輔助提取法是通過機械振動產生能量在介質中傳播而使物質分子發生碰撞產生新物質的過程，該方法是一項易掌握，較為安全、提取溫度低、時間快、提取率相對高的新技術，已廣泛應用于中草藥油脂的提取[7-9]。本實驗利用超聲輔助提取法，通過單因素和正交實驗優化了廣西莪術揮發油提取工藝，并分析了揮發油的抗氧化和抗菌活性，以期為莪術油進一步開發利用提供基礎理論參考。

1 材料與儀器

1.1 實驗材料

廣西莪術購自亳州市眾益堂中藥材銷售有限公司，經廣西科技師范學院特色瑤藥資源研究與開發重點實驗室張鵬博士鑒定為廣西莪術。DPPH購自上海思誠化工科技有限公司；鐵氰化鉀、乙醇、雙氧水等試劑均為分析純，購自武漢長城化成科技發展有限公司；枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌來自廣西科技師范學院實驗樓微生物實驗室。

1.2 實驗儀器

RE-52AA型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(III)型循環水多用真空泵，鞏義市科瑞儀器有限公司；BILON-S6多頻恒溫超聲波提取機，上海比朗儀器制造有限公司；UV-9600型紫外/可見分光光度計，北京北分瑞利分析儀器公司；SPX-250B-Z型生化培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1F型潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

2 實驗方法

2.1 超聲輔助提取工藝優化方法

2.1.1 超聲輔助提取揮發油方法

將烘干的莪術粉碎后過60目篩，準確稱取過篩的莪術粉末20.0 g于500 mL燒杯中，加入一定量的無水乙醇，混勻后放入多頻恒溫超聲波提取器中，以一定的功率提取一定時間后，抽濾數次至濾紙無殘渣，濾液倒入已稱重的圓底燒瓶內，在旋轉蒸發儀上揮干溶劑，于恒溫干燥箱中干燥后冷卻至室溫稱重，按以下公式計算提取率：

(1)

式中m1為莪術粉質量；m2為空瓶質量；m3為莪術油加瓶總質量。

2.1.2 單因素實驗

利用超聲輔助提取法，分析無水乙醇與莪術粉的比例(A)、超聲功率(B)和提取時間(C)三個因素對揮發油提取率的影響。單因素梯度設為：無水乙醇與莪術粉的比例依次為9:1、12:1、15:1、18:1、21:1 mL/g；提取時間分別設為5、10、15、20、25 min；超聲功率設定為600、700、800、900、1000、1100、1200 W。每個單因素用料量為20 g。選定一組單因素條件實驗后，其他因素條件逐一進行實驗。

2.1.3 正交實驗

根據單因素實驗結果每個因素選擇3個水平進行正交實驗。正交實驗后通過極差分析得出超聲輔助提取廣西莪術揮發油的最佳提取條件。

2.2 體外抗氧化活性測定方法

2.2.1 還原能力測定

由于還原能力的強弱可以反映藥物潛在的抗氧化性能，因此首先對分離的揮發油進行了還原能力測定。分別取2.0 mL樣品溶液或對照品(Vc)溶液(6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL)依次加入等體積的pH 6.6磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液，混勻后在50 ℃水浴中保溫大約20 min。再加入2.0 mL的10%的三氯乙酸溶液。取3.0 mL上述混合液，加入等體積去離子水和0.6 mL的0.1% FeCl3溶液，靜置10 min以后。在700 nm下測定各樣品的吸光值。測得的吸光值越大說明樣品的還原能力越強[10]。

2.2.2 清除DPPH自由基能力測定

在10.0 mL 60 μmol/L的DPPH·乙醇溶液中加入2.0 mL 樣品或對照品(Vc)溶液，25 ℃放置30 min后在517 nm測得吸光值[9]。自由基清除百分率SE(%)按下式計算。

(2)

式中A0是溶劑為空白的吸光值；AX為加入了樣品或對照品溶液的吸光值；AY為乙醇代替顯色劑時樣品或對照品的吸光值。

2.2.3 清除羥基自由基(·OH)能力測定

本實驗采用Fenton法[10-11]測定超聲輔助提取的莪術揮發油對羥基自由基的清除能力。樣品和對照品Vc的濃度依次設定為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。對·OH的清除率SE(%)按(2)式計算。其中A0為以溶劑代替樣品或對照品的試劑空白吸光值。

2.3 抗菌活性測定方法

本實驗采用濾紙片擴散法[13]對超聲輔助提取的莪術油的抗菌活性進行研究。先取200 μL濃度為105～106cfu/mL的菌懸液于干凈無菌空皿上，將熔化冷卻至45 ℃左右的培養基快速倒入并水平轉動與菌懸液混勻。待混合皿凝固后，用滅菌過的鑷子取出浸有樣液的濾紙片，選好距離放在混合皿上，每組設陽性對照樣片，陰性對照樣片。貼好濾紙片后倒置放入培養箱，37 ℃恒溫培養12～18 h后，測量各抑菌圈的大小。按照抑菌圈直徑d>15 mm為抑菌敏感，15 mm>d>7 mm為有抑菌效果，d<7 mm為無抑菌效果，分別記錄各樣品組和陽性對照組的實驗結果。

3 結果與討論

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 液料比對揮發油提取率的影響

從圖1中可以看出在提取時間15 min、超聲功率1000 W時，不同液料比對揮發油提取率的影響。液料比小于15:1 mL/g時，液料比增大提取率不斷升高；當液料比大于15:1 mL/g時，提取率開始下降。結果表明最佳液料比為15:1 mL/g時，揮發油的提取率為4.21%。

圖1 液料比對揮發油提取率的影響

3.1.2 提取時間對揮發油提取率的影響

根據上述單因素實驗結果，選擇在液料比15:1 mL/g和超聲功率為1000 W時，測定超聲時間對提取率的影響，實驗結果(見圖2)表明隨著超聲波提取時間的延長提取率逐漸增大但是超過15 min后提取率的增加并不顯著。從整體工藝的效率考慮確定了最佳提取時間為15 min，此時提取率為4.28%。

圖2 超聲提取時間對揮發油提取率的影響

3.1.3 超聲波功率對揮發油提取率的影響

從圖3可以看出，在液料比為15:1 mL/g和超聲提取時間為15 min時，莪術油的提取率隨著超聲波提取功率的增加先增大后減小。在超聲功率小于1000 W時，超聲功率越大超聲機械振動頻率越大，物質分子降解能力越強，莪術油的提取率也越高，但是當超聲功率超過1000 W后，提取率基本不再增加甚至有下降的趨勢，可能是因為超聲功率過大時揮發油收集效率受到一定影響。當超聲波提取功率為1000 W時提取率為4.30%。

圖3 超聲波功率對揮發油提取率的影響

3.2 正交實驗結果

根據單因素實驗結果設計正交實驗表，如表1所示。

表1 正交實驗水平因素表

按照正交實驗表實驗后得到正交實驗結果見表2。

表2 正交實驗結果表

正交實驗結果顯示最佳工藝條件組合為A2B3C2。此組合與正交表中最佳水平條件組合A3B3C2不一致。因此按照A2B3C2條件重新測定了超聲提取揮發油的含量，最后得提取率為4.35%。于是確定最佳工藝條件為液料比15:1 mL/g，超聲功率1000 W，超聲時間20 min。

3.3 生物活性

3.3.1 還原能力測定結果

從圖4可以看出揮發油在一定濃度范圍(6.25 μg/mL～200 μg/mL)內的還原能力隨著樣品濃度增大還原性不斷增強，并且可知揮發油的還原性僅次于陽性對照品Vc。

圖4 還原能力測定曲線圖

3.3.2 清除自由基能力測定結果

圖5 揮發油和Vc對DPPH·、·OH和清除率(%)的影響

3.3.3 抗菌活性結果

本實驗采用抑菌圈法分析的揮發油對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抑菌作用結果(表3)顯示莪術油濃度為1.5 mg/mL時對三種均都有一定的抑菌效果，其中對金黃色葡萄球菌抑制作用較好。當濃度為2.0 mg/mL時對枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有較明顯的抑制作用。

表3 抑菌結果匯總表

4 結 論