漢中市食源性沙門菌的分布及耐藥性分析

湯 進(jìn)， 馬國柱， 黃曉霞， 陳雅莉， 孔花娟， 柏 瑩， 李景源， 鄭春梅

（1. 漢中市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 漢中 723000；2.陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710000；3.漢中市疾病預(yù)防控制中心，陜西 漢中 723000）

沙門菌屬是腸桿菌科中一類分布廣泛、血清型多、抗原復(fù)雜的腸道致病菌，為人畜共患病原，是引起感染性腹瀉和食物中毒的重要致病菌，在臨床上引起的常見疾病包括傷寒、副傷寒、胃腸炎和食物中毒。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2010—2015年，在5.82億例合計(jì)22種不同食源性腸道疾病患者中，死亡35萬余例，其中沙門菌引起的食源性腸道感染5.2萬例，致病性大腸埃希菌引起的食源性腸道感染3.7萬例，諾如病毒引起的食源性腸道感染3.5萬例[1]，沙門菌成為食源性致病菌的重點(diǎn)監(jiān)控細(xì)菌[2]。我國居前5位的致病微生物性食物中毒由高到低分別為：沙門菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽胞桿菌[3]，每年由沙門菌引起的食物中毒事件占全部食物中毒事件的40%～60%[4]。本研究對(duì)2018年漢中地區(qū)食源性沙門菌的分布及其耐藥性進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2018年被確診為食源性疾病引起腹瀉且從其糞便樣本中分離出沙門菌的患者53例，其中漢中市中心醫(yī)院24例、漢中市人民醫(yī)院7例、漢中市3201醫(yī)院22例。

1.2 儀器與試劑

沙門菌顯色培養(yǎng)基（上海科瑪嘉公司）、SC增菌液、XLD瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和MH平板（廣州迪景公司），藥物敏感性試驗(yàn)紙片（溫州康泰公司）、沙門菌血清分型試劑（杭州天潤公司、泰國S&A公司）。WalkAway plas全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（美國貝克曼公司）、全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（美國BD公司）、API手工鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）。CHEF-mapper型脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及配套設(shè)備（美國Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（法國VL公司）。溶菌酶、苯甲基磺酰氟（美國Sigma公司），蛋白酶L（德國Merck公司），限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、電泳級(jí)瓊脂糖（美國Promega公司），低熔點(diǎn)瓊脂糖（美國Bio-Rad公司）。質(zhì)控菌株傷寒沙門菌（CMCC 50071）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、糞腸球菌（ATCC 29212）、金黃色葡萄球菌（ATCC 29213、ATCC 25922）及標(biāo)準(zhǔn)菌株購自溫州康泰公司。

1.3 菌株鑒定及體外藥物敏感性試驗(yàn)

按細(xì)菌性腹瀉臨床實(shí)驗(yàn)室診斷操作指南（WS/T 498-2017）要求采集患者使用抗菌藥物前糞便樣本。將樣本分別接種于SC增菌液、哥倫比亞血瓊脂平板、XLD瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，35℃培養(yǎng)24～72 h。采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和API手工鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，并通過沙門菌血清分型試劑進(jìn)行確認(rèn)。測(cè)定待檢菌株的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2018-M100-S28文件要求進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)和結(jié)果判定。所有鑒定和體外藥物敏感性試驗(yàn)均采用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控。

1.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型

挑取單個(gè)菌落，接種于3 mL的LB肉湯，37 ℃震蕩培養(yǎng)16 h，16 000 ×g離心1 min，棄上清，加細(xì)胞懸浮液，重復(fù)2次，與等體積的2%低熔點(diǎn)瓊脂糖混勻，將混合物加入模具孔中，待其凝固后加溶菌酶、蛋白酶K，待膠塊透明后浸入TE緩沖液中，4 ℃保存。切取膠塊，加入1 μL限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ，37 ℃過夜酶切后，將膠塊及Maker放入1%的瓊脂糖凝膠孔中電泳。電泳條件為：0.5×TBE電泳緩沖液、冷卻溫度14 ℃、6 V、120 ℃、5～45 s、26 h。電泳結(jié)束后，凝膠用溴化乙錠染色20～30 min，脫色15 min，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Whonet 5.6軟件及SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用例或率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 沙門菌血清型和耐藥性分析

分離出的53株沙門菌中，包括7種血清型：鼠傷寒沙門菌（26株）、腸炎沙門 菌（13株）、斯坦利沙門菌（6株）、倫敦沙門菌（3株）、湯卜遜沙門菌（2株）及埃森沙門菌（1株）。所有菌株均對(duì)哌拉西林的耐藥率最高（97.74%），對(duì)四環(huán)素和氨芐西林的耐藥率分別為65.81%和55.03%；對(duì)美羅培南、厄他培南、莫西沙星、亞胺培南的耐藥率均為0；對(duì)碳青酶烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均＜10%，對(duì)氨基糖苷類和頭孢類抗菌藥物的耐藥率為10%～30%。腸炎沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率僅為7.70%，遠(yuǎn)低于其他6種血清型（65.81%～100%）。

2.2 PFGE分型及聚類分析結(jié)果

采用PFGE對(duì)分離的腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌進(jìn)行分型，結(jié)果用 BioNumerics（5.1）軟件進(jìn)行聚類分析，相似性100%的PFGE指紋譜帶型的鼠傷寒沙門菌只有3組，每組2株菌。腸炎沙門有3組，其中1組有7株菌，其余2組均為2株菌。見圖1、圖2。

圖1 鼠傷寒沙門菌PFGE分型及聚類分析

圖2 腸炎沙門菌PFGE分型及聚類分析

2.3 食源性沙門菌感染患者性別和年齡分布

53例患者中，男性29例、女性24例，男性、女性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；0～3歲患者31例（58.4%），3～14歲患者10例（18.9%），14～65歲患者2例（3.8%），65歲以上患者10例（18.9%）。其主要感染人群為嬰幼兒和14歲以下兒童（77.3%），其次為65歲以上人群（18.9%），65歲以下的成年人僅占3.8%。

3 討論

沙門菌感染與機(jī)體免疫力高度相關(guān)，本研究中的53例食源性沙門菌感染患者中，14歲以下及65歲以上者占96.2%，提示這些人群相對(duì)免疫力較弱，易發(fā)感染。

本研究分離出的53株沙門菌中，包括7個(gè)血清型，居前3位的分別是鼠傷寒沙門菌（26株，49.05%）、腸炎沙門菌（13株，24.52%）、斯坦利沙門菌（6株，11.32%），與譚南等[5]的研究結(jié)果一致，但與劉翔等[6]的研究結(jié)果有差異，提示食源性沙門菌感染有地域特點(diǎn)。

本研究結(jié)果表明，沙門菌對(duì)碳青酶烯類和氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率均＜10%，對(duì)氨基糖苷類和頭孢類抗菌藥物的耐藥率為10%～30%，與王宵雪等[7]的報(bào)道一致。沙門菌對(duì)哌拉西林、四環(huán)素和氨芐西林的耐藥率較高，分別為97.74%、65.81%和55.03%，明顯高于王宵雪等[7]報(bào)道的北京地區(qū)的23.26%、11.63%和20.09%。但腸炎沙門菌對(duì)四環(huán)素的耐藥率僅為7.70%，遠(yuǎn)低于其他6種血清型，這是漢中地區(qū)沙門菌耐藥性的一個(gè)特點(diǎn)。

PFGE分型技術(shù)分辨率高、重復(fù)性好，為確定菌株之間的親緣關(guān)系提供了可靠的技術(shù)手段，被廣泛認(rèn)為是細(xì)菌流行病學(xué)研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8-10]。本研究對(duì)分離的26株鼠傷寒沙門菌進(jìn)行PFGE分型和聚類分析，發(fā)現(xiàn)其譜型相似度為58.20%～100%，但分別來自不同醫(yī)院，且分離出的其余各株菌相似度均不到100%，提示鼠傷寒沙門菌在漢中地區(qū)以散發(fā)為主。對(duì)分離出的13株腸炎沙門菌進(jìn)行PFGE分型和聚類分析，發(fā)現(xiàn)有3組譜型相似度為100%，這3組具有同源性的菌株分別來自3家醫(yī)院，提示漢中地區(qū)腸炎沙門菌感染具有一定同源性。經(jīng)過對(duì)臨床病例的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，這13例患者中有7例在發(fā)病前有食用禽蛋類食品史，禽蛋類食品是沙門菌較易污染的食品種類[11-12]，故被污染的禽蛋類食品極有可能是其傳播途徑。

如果本研究結(jié)果能結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果進(jìn)一步分析，對(duì)漢中地區(qū)食源性沙門菌的感染和預(yù)防將起到更大的作用。