唾液酸化觸珠蛋白對乙型肝炎相關肝細胞肝癌的輔助診斷價值

別立翰， 房 萌， 馮惠娟， 陸志成， 高春芳

（1. 上海東方肝膽外科醫院實驗診斷科，上海 200438；2. 上海中醫藥大學附屬第七人民醫院醫學檢驗科，上海 200137）

在我國腫瘤總體發病率中，原發性肝癌居第4位，其引起的死亡率居腫瘤總體死亡率的第2位，肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是其主要的病理類型[1]。在我國，80%的HCC由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起，乙型肝炎相關肝硬化患者是HCC的高危人群[2]。超聲及甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）聯合檢測常作為早期肝癌的常規篩查手段，但肝硬化患者的肝臟回聲增粗影響了超聲對小肝癌的識別。Meta分析結果顯示，對于肝硬化患者早期肝癌的診斷，超聲的敏感性只有47%，超聲聯合AFP后敏感性可提高至63%[3]。糖基化是蛋白質翻譯后的主要修飾形式，腫瘤發生過程中蛋白質等的異常糖基化賦予了腫瘤細胞新的生物學特性，影響著腫瘤的增殖、侵襲、轉移、抗凋亡、免疫逃逸及血管生成[4]。巖藻糖基化及唾液酸化是2種主要的糖基化修飾。異常糖鏈結構的蛋白，如甲胎蛋白異質體（Lens culinaris-agglutinin-reactive fraction of alpha-fetoprotein，AFP-L3）和α2，3唾液酸化前列腺特異性抗原等可作為腫瘤標志物用于相關腫瘤的診斷[5]。

觸珠蛋白是主要由肝臟合成分泌的一種酸性糖蛋白，屬于急性時相反應蛋白。觸珠蛋白分子結構類似于免疫球蛋白，有2條β鏈（相對分子質量為40 000）、2條α鏈（α1、α2鏈的相對分子質量分別為9 100和16 000）。觸珠蛋白的主要功能是結合并攜帶游離的血紅蛋白在肝臟中被降解，以防止發生血管內溶血時腎臟受損。有研究結果顯示，觸珠蛋白在多種腫瘤發生時糖基化修飾發生改變，如胰腺癌、肝癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌和胃癌[6]。本研究采用本課題組前期研發的乏糖基觸珠蛋白抗體捕獲血清觸珠蛋白，使用可與α2，6唾液酸特異性結合的接骨木黑凝集素（sambucus nigra lectin，SNA）檢測觸珠蛋白上的唾液酸，建立凝集素-酶聯免疫吸附試驗（Lectin enzyme-linked immunosorbent assay，Lectin-ELISA）方法，探討唾液酸化觸珠蛋白（sialylated haptoglobin，Sia-Hp）在HCC早期篩查中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1—12月在上海東方肝膽外科醫院被確診為乙型肝炎相關肝硬化的患者236例，其中肝硬化伴HCC患者121例（HCC組，男112例，女9例，年齡48～60歲）、肝硬化不伴HCC患者115例（肝硬化組，男80例，女35例，年齡48～63歲）。收集所有患者的實驗室檢測資料及HCC患者的病理資料[腫瘤TNM分期、微血管侵犯（microvascular invasion，MVI）和腫瘤大小]。HCC診斷依據《原發性肝癌診療規范（2017年版）》[7]，肝硬化診斷依據《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）[8]。另選取同期上海東方肝膽外科醫院健康體檢者107名作為正常對照組（男53名，女54名，年齡24～41歲）。本研究經海軍軍醫大學倫理委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 HCC組 （1）有明確的HBV感染病史；（2）經手術治療的患者病理明確診斷為肝硬化伴HCC；（3）排除 HBV之外的其他病毒感染，如甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等；（4）排除其他臟器的嚴重疾病或惡性腫瘤；（5）排除其他原因引起的慢性肝病。

1.2.2 肝硬化組 （1）有明確HBV感染史；（2）臨床診斷為慢性乙型肝炎相關肝硬化；（3）排除其他原因引起的肝硬化，如原發性膽汁性肝硬化、酒精性肝硬化、血吸蟲肝硬化等。

1.2.3 正常對照組 （1）無肝臟疾病史，肝臟生化指標均正常；（2）排除腫瘤、感染性疾病、重要臟器的嚴重疾病及自身免疫性疾病等。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集HCC患者術前靜脈血3 mL，采集肝硬化患者及正常對照者空腹靜脈血3 mL，2 100×g離心10 min，分離血清，-80 ℃保存待用。由于觸珠蛋白具有與血紅蛋白結合的生物學特性，溶血會對檢測結果造成較大影響，因此需剔除溶血樣本。

1.3.2 實驗室檢測資料 收集所有對象的實驗室檢測資料，包括總膽紅素（total bilirubin，TB）、總蛋白（total protein，TP）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、白細胞（white blood cell，WBC）計數、AFP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）。

1.3.3 檢測Sia-Hp的Lectin-ELISA方法的建立 將乏糖基觸珠蛋白抗體以4 μg/mL包被在96孔板中。使用Carbo-Free Blocking Solution（美國Vector Laboratories公司）封閉板孔，以減少非特異性吸附。用含0.1% Tween-20的磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS），即PBST洗板。用Low cross buffer（德國CANDOR Bioscience公司）將血清稀釋10 000倍，以100 μL/孔加樣，室溫孵育1 h。使用PBS將生物素化SNA（美國Vector Laboratories公司）稀釋10 000倍，每孔加入100 μL，室溫避光放置1 h。以100 μL/孔加入過氧化物酶標記的親和素（美國R&D System公司），室溫孵育40 min后加入四甲基聯苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）顯色，在450 nm處讀取吸光度（A）值。每份樣本雙復孔檢測，檢測結果的單位為AU/mL。將提前制備的混合血清與樣本一同檢測，以混合血清為參照，取樣本A值與混合血清A值的比值，以降低檢測的批間及批內誤差。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。呈非正態分布的數據以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關分析評估各項指標之間的相關性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價Sia-Hp、AFP診斷肝硬化合并HCC的效能，曲線下面積（area under curve，AUC）比較采用Z檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC組、肝硬化組和正常對照組一般資料的比較

HCC組、肝硬化組和正常對照組之間年齡、TB、TP、ALT、WBC計數、AFP、CEA差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HCC組、LC組和正常對照組一般資料的比較 M（P25～P75）

2.2 HCC組、肝硬化組和正常對照組血清Sia-Hp水平的比較

HCC組、正常對照組、肝硬化組血清Sia-Hp水平分別為1.76（1.32～2.22）、1.60（1.17～1.69）、0.85（0.11～1.56）AU/mL，3組之間依次降低（P＜0.001）。見圖1。

2.3 血清Sia-Hp水平與臨床病理特征的關系

Spearman等級相關分析結果顯示，HCC組和肝硬化組Sia-Hp與AFP無相關性（r=0.09，P＞0.05）。

在HCC組中，TNM 1期患者的血清Sia-Hp水平低于TNM 2+3+4期（P＜0.05），有MVI的患者與無MVI的患者之間以及腫瘤＜3 cm、3～5 cm、＞5 cm的患者之間血清Sia-Hp水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。肝硬化組不同Childpugh分級患者之間血清Sia-Hp水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

2.4 Sia-Hp診斷肝硬化合并HCC的效能

ROC曲線分析結果顯示，Sia-Hp診斷肝硬化合并HCC的AUC[95%可信區間（confidence interval，CI）]為0.83（0.77～0.88），最佳臨界值為1.06 AU/mL，敏感性為95.0%，特異性為56.5%。AFP診斷肝硬化合并HCC的AUC（95%CI）為0.78（0.72～0.84），以20 μg/L為診斷臨界值時，敏感性為55.4%，特異性為80.9%。Z檢驗結果顯示，Sia-Hp與AFP診斷肝硬化合并HCC的AUC差異無統計學意義（Z=1.12，P＞0.05）。見圖3。

圖1 HCC組、肝硬化組和正常對照組血清Sia-Hp水平的比較

圖2 HCC組不同病理特征之間及肝硬化組不同Child-Pugh分級之間血清Sia-Hp水平的比較

采用多因素Logistic回歸分析建立基于AFP和Sia-Hp的聯合檢測模型DIAHCC，DIAHCC=2.755×Sia-Hp+1.852×logAFP-5.756。ROC曲線分析結果顯示，聯合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的AUC（95%CI）為0.92（0.89～0.96），最佳臨界值為0.475，敏感性為88.4%，特異性為84.3%。Z檢驗結果顯示，聯合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的AUC高于AFP、Sia-Hp（P＜0.001）。見圖3。

2.5 Sia-Hp及聯合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性患者肝硬化合并HCC的效能

以AFP＜20 μg/L為AFP陰性。HCC組有54例患者血清AFP為陰性，其血清Sia-Hp水平為1.84（1.62～2.27）AU/mL。肝硬化組有93例患者血清AFP為陰性，其血清Sia-Hp水平為1.16（0.14～1.64）AU/mL。2個組AFP陰性者之間血清Sia-Hp水平差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖3 Sia-Hp、AFP和聯合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的ROC曲線

ROC曲線分析結果顯示，Sia-Hp和聯合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性患者肝硬化合并HCC的AUC（95%CI）分別為0.84（0.77～0.90）、0.88（0.82～0.94），分別以1.06 AU/mL、0.475作為臨界值，敏感性分別為96.3%、77.8%，特異性分別為49.5%、89.2%。Z檢驗結果顯示，Sia-Hp和聯合檢測模型DIAHCC的AUC之間差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Sia-Hp及聯合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性患者肝硬化合并HCC的ROC曲線

3 討論

腫瘤發生過程中出現的異常唾液酸修飾可賦予腫瘤不良的生物學特性。ZHAO等[9]對101例肝癌患者的癌組織及癌旁組織中20種唾液酸轉移酶的表達進行研究，結果顯示，癌組織中催化形成α2，6唾液酸的α2，6唾液酸轉移酶1（ST6 beta-galactoside alpha-2，6-sialyltransferase 1，ST6GAL1）的表達明顯高于癌旁組織（P＜0.05），他們還發現肝癌細胞系MHCC97 H中ST6GAL1的表達量比MHCC97 L高了近5倍。由此可見，隨著腫瘤的發生、發展，腫瘤細胞α2，6結構的唾液酸修飾增多，因此主要由肝臟分泌的α2，6唾液酸修飾的蛋白或可作為腫瘤早期診斷的指標。近80%的肝癌患者由HBV感染相關肝硬化發展而來，肝硬化是乙型肝炎相關肝癌的獨立危險因素[10]。因此，探索乙型肝炎相關肝硬化發展成為肝癌的早期篩查指標對于患者預后意義重大。LI等[11]的研究結果顯示，男性、AFP＞200 ng/mL、HBV感染家族史是年輕乙型肝炎相關肝硬化患者快速進展為肝癌的危險因素，應盡早進行肝癌篩查。

ANG等[12]使用凝集素純化及雙向電泳技術對血清觸珠蛋白進行研究，結果顯示，肝癌患者血清觸珠蛋白唾液酸化程度高于慢性肝病患者，且Sia-Hp與腫瘤分期相關。本研究為了探討Sia-Hp輔助診斷HCC的價值，首先構建了檢測Sia-Hp的Lectin-ELISA方法，所使用的乏糖基觸珠蛋白抗體不含唾液酸，從而降低了檢測體系的本底，提高了檢測靈敏度，所采用的SNA可與觸珠蛋白β鏈上的α2，6唾液酸特異性結合。

本研究結果顯示，HCC患者血清Sia-Hp水平高于肝硬化患者和正常對照者（P＜0.001），肝硬化患者血清Sia-Hp水平最低。針對觸珠蛋白N-糖鏈的質譜分析結果顯示，HCC患者血清觸珠蛋白N-糖鏈結構上的唾液酸含量高于肝硬化患者[13]。本研究采用Lectin-ELISA得出的檢測結果與文獻報道[14]相似。

腫瘤TNM分期是評價患者預后的指標。本研究結果顯示，TNM 1期HCC患者的血清Sia-Hp水平低于TNM 2+3+4期HCC患者（P＜0.05），提示Sia-Hp有預測患者預后的潛能。MVI是HCC患者手術預后和總生存期的獨立危險因素，在不同TNM分期的HCC患者中均有發生。LEI等[15]的研究結果顯示，約有30%的HBV相關HCC患者會發生MVI，且MVI與HCC患者腫瘤大小、腫瘤多發結節、包膜不完整和高HBV DNA載量有關。MVI作為HCC患者術后病理檢查的指標，目前尚缺乏相關的血清標志物。本研究結果顯示，有MVI的HCC患者血清Sia-Hp水平雖稍高于無MVI的HCC患者，但差異無統計學意義（P＞0.05），且不同腫瘤大小的HCC患者之間血清Sia-Hp水平差異亦無統計學意義（P＞0.05），肝硬化組不同Child-pugh分級之間血清Sia-Hp水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。

ROC曲線分析結果顯示，基于Sia-Hp和AFP建立的聯合檢測模型DIAHCC診斷肝硬化合并HCC的AUC高于AFP、Sia-Hp（P＜0.001），Sia-Hp與AFP的AUC差異無統計學意義（P＞0.05）。在AFP陰性患者中，Sia-Hp對肝硬化合并HCC仍有良好的診斷效能（AUC為0.836）。有研究結果顯示，有15%～30%的肝癌患者血清AFP不升高[14]。依據《原發性肝癌診療規范（2017年版）》[7]，以AFP＜20 μg/L為AFP陰性，聯合檢測模型DIAHCC診斷AFP陰性的肝硬化合并HCC的敏感性和特異性分別為77.8%和89.2%。這提示在AFP陰性的人群中，聯合檢測模型DIAHCC對HCC也有較好的診斷效能。

綜上所述，Sia-Hp在肝硬化合并HCC的輔助診斷中有一定的價值，且與AFP聯合檢測時診斷效能更高，或可作為HCC的輔助診斷標志物之一。另外，由于唾液酸化還可影響腫瘤的侵襲、轉移，且唾液酸轉移酶的表達與患者預后有關，因此Sia-Hp可能在HCC的預后評估中也有一定的價值。