石菖蒲揮發油中主要成分α-和β-細辛醚的神經藥理學作用及機制研究進展

徐飛飛，李欽青，楚世峰，賀文彬*

1山西中醫藥大學 中醫腦病學山西省重點實驗室，太原 030624；2中國醫學科學院藥物研究所，北京 100050

傳統中藥石菖蒲(A.tatarrinowiiSchott)始載于《神農本草經》，來源于多年生草本植物石菖蒲的干燥根莖，其氣味芳香，性辛，味苦，溫，歸胃、心經，作為一種開竅藥被廣泛熟知[1]。石菖蒲具有化濕開胃、豁痰鎮咳、醒神益智等功效，現代臨床主要將其應用于治療消化道疾病，如由于濕導致的胃痛、腹痛；以及神經系統疾病，如痰癥導致的昏迷、健忘等癥[2]。石菖蒲中含有揮發油類、黃酮類、醌類、生物堿類、三萜皂苷類、苯丙素類、有機酸類、氨基酸類及糖類等多種化合物，其中揮發油類為石菖蒲的主要有效成分，揮發油含量隨種類和產地的不同而變化[3]。α-細辛醚和β-細辛醚作為揮發油中主要活性成分，發揮廣泛且重要的藥理作用[4]，揮發油類各化學成分占比詳見圖1。現今越來越多的研究已經證實它們在神經系統、心血管系統以及免疫系統中的顯著作用[5]，尤其在抗神經系統疾病的研究中，α-和β-細辛醚已經引起國內外學者的高度重視。

α-和β-細辛醚二者互為同分異構體，分子式為C12H16O3，見圖2。因其揮發油特性，α-和β-細辛醚能夠快速通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)發揮藥理活性[6]，研究表明它們對于神經系統疾病，如輕度認知功能障礙、抑郁癥、帕金森病、癲癇和腦卒中等疾病均有潛在治療優勢[7-11]。本文主要對α-和β-細辛醚的神經系統藥理作用及機制進行總述，重點探討其在抗腦缺血再灌注損傷引起的級聯反應中的潛在機制，作用機制詳見表1。

圖1 石菖蒲揮發油類化學成分比例圖Fig.1 Proportion of chemical components of volatile oils注：Flavonoids(黃酮類)；Alkaloids(生物堿類)；Aminoacids(氨基酸類)；Triterpenoid saponins(三萜皂苷類)；Saccharides(糖類)；Volatile oils(揮發油類)；γ-Asarone(γ-細辛醚)；β-Caryophyllene(β-石竹烯)；Methyleugenol(甲基丁香酚)；β-Pinene(β-蒎烯)。

圖2 α-細辛醚和β-細辛醚的化學結構Fig.2 Chemical structures of α-asarone and β-asarone

1 對輕度認知功能障礙的作用

輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment)是機體正常衰老和癡呆之間的過渡階段，臨床表現伴隨有輕微但可檢測到的認知功能損傷。腦內膽堿能系統損害、氧化應激、興奮性神經毒性以及突觸與神經元的退化等眾多因素，均能夠引起機體輕度認知功能障礙[12]。中草藥用于治療認知功能障礙近年來得到越來越多研究，其中石菖蒲作為益智方配伍中的基礎藥物，其有效成分α-細辛醚和β-細辛醚已成為研究熱點。

在對慢性鉛暴露引起的大鼠認知障礙的研究中，β-細辛醚能迅速通過血腦屏障，明顯提高大鼠海馬CA1區和齒狀回區樹突棘密度，對鉛誘導的空間學習記憶障礙有一定的神經保護作用[13]。對于膽堿能系統損害以及海馬內Aβ沉積引起的認知障礙，Deng等[14]發現β-細辛醚能夠同時降低APP/PS1轉基因小鼠海馬體中乙酰膽堿酯酶(AChE)和Aβ42水平，也有研究認為β-細辛醚可通過保護星形膠質細胞緩解Aβ沉積，也能夠通過調節氧化應激及相關蛋白表達從而改善認知障礙[15,16]。雖然相對于β-細辛醚，α-細辛醚在學習記憶領域的研究不多，但早在2002年，Cho等[17]在體外實驗中發現，它能夠通過阻斷N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體活性，抑制大鼠皮層神經元谷氨酸所致的興奮性毒性，從而產生抗氧化和神經保護作用；并且在最新的研究[18]中這一作用機制得到印證，本課題組的前期研究結果證實α-細辛醚(15、30 mg/kg，i.p.)能夠降低小鼠海馬體內鈣超載，通過調節谷氨酸相關受體蛋白的異常表達，包括α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，AMPA)受體、谷氨酸轉運體-1(glutamate transporter 1，GLT-1)及NMDA受體，降低谷氨酸蓄積過多引起的興奮性神經毒性，從而改善乙醇誘導的認知功能障礙小鼠的學習記憶行為表現。

2 對抑郁癥的作用

抑郁癥(depression disorder)是一種持續而嚴重的精神疾病，其臨床表現以精神低落為主，并伴有焦躁不安、活力喪失以及注意力減退等癥狀，嚴重者會出現自殘及自殺行為。抑郁癥在2020年取代冠心病，成為世界第二大負擔疾病[19]。在世界自殺人群中，抑郁癥患者已占到了三分之二，預估到2030年，抑郁癥將成為全球最大的死亡原因[20,21]。抑郁癥作為一種多因素疾病，其發病機制主要有炎癥假說、谷氨酸神經遞質異常假說、神經營養因子假說以及下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸異常假說等[22-25]。

研究證實[25]低劑量石菖蒲提取精油對小鼠自主活動不具有顯著影響，并且在此前提下，它們能夠調節去甲腎上腺素能與5-羥色胺能系統，改變抑郁模型小鼠在懸尾實驗中的行為表現，產生一定的抗抑郁樣效應。同樣，Wang等[27]通過評價石菖蒲超臨界萃取物，證實在萃取物藥液的作用下，抑郁模型大鼠的抑郁樣行為癥狀也得到不同程度的改善。β-細辛醚能夠顯著增加慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)誘發的抑郁癥大鼠糖水消耗量；并且在懸尾行為測試中，β-細辛醚組與CUMS模型組大鼠相比，懸尾靜止時間降低了29%(P< 0.05)。除改善抑郁樣行為之外，他們通過對大鼠海馬CREB-ERK1/2-BDNF蛋白水平的測定，結果顯示CREB、ERK1/2磷酸化水平及BDNF水平均顯著增加，RT-PCR實驗結果與WB結果相一致，所以β-細辛醚改善CUMS大鼠體重降低、缺氧以及明顯的抑郁樣行為，可能的機制是通過調節神經元的存活表現出抗抑郁作用[28]。同樣，有研究[29]發現α-細辛醚也能夠通過調節抑郁小鼠海馬p-CREB水平能夠減輕抑郁樣行為。不過Chellian等[30]研究發現α-細辛醚能使小鼠在懸尾實驗中能夠激發雙向作用，即在較低劑量(15和20 mg/kg，i.p.)出現抗抑郁樣作用，在相對較高劑量(50和100 mg/kg，i.p.)下則出現了抑郁樣行為。他們提示低劑量α-細辛醚的抗抑郁作用可能是通過調節去甲腎上腺素能(α1和α2腎上腺素受體)和5-羥色胺能系統(特別是5-HT1A受體)介導。調節5-羥色胺能系統是現今治療抑郁癥藥物的主要作用機理，α-細辛醚能夠調節5-羥色胺能系統的研究結論，以及β-細辛醚對抑郁樣行為的顯著改善作用，這意味著α-和β-細辛醚可以作為改善抑郁癥的潛在化合物開發并值得進一步研究。

3 對帕金森病的作用

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種與年齡相關的常見于中老年人的中樞神經系統退行性疾病，以靜息性震顫、運動遲緩、癡呆、步態紊亂和姿勢不穩為主要臨床表現[31]。帕金森病病因復雜，尚無統一明確的發病機制，但多數研究認為與氧化應激、炎性反應相關[32,33]。帕金森病主要的病理改變特征是黑質多巴胺(DA)能神經元變性缺失以及α-突觸核蛋白(α-synuclein)沉積。

早在1965年Dandiya等[34]通過觀察大鼠行為，提出細辛醚預處理能夠完全消除tremorine(三尖杉堿，一種毒蕈堿激動劑)引起的帕金森病樣癥狀，如頭部和四肢震顫、肌力低下和肌肉僵硬，認為可將細辛醚作為抗帕金森藥物進一步研究并探討其作用機制。近年來，Huang等[35-38]于2014年至2017年豐富了β-細辛醚抗帕金森病的作用機制。起初，通過β-細辛醚與Levodopa(左旋多巴，帕金森治療藥物)聯合用藥發現，β-細辛醚能夠通過調節DA降解酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)活性和多巴胺(DA)代謝而影響左旋多巴向DA的轉化[35]；后來發現β-細辛醚能夠下調自噬相關蛋白Beclin-1和LC3B表達，增加P62蛋白表達來發揮作用[36]；另外他們還認為β-細辛醚夠通過調節血腦屏障P-糖蛋白和緊密連接蛋白，促進左旋多巴進入腦內，提高大鼠紋狀體多巴胺水平[37]。總之，β-細辛醚作用效果是積極的，它能通過提高血腦屏障通透性，下調自噬相關蛋白對帕金森病起到輔助治療作用。Zhang等[39]以MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)誘導的PD小鼠模型和體外培養的SH-SY5Y細胞為模型，觀察β-細辛醚對PD的影響，認為β-細辛醚通過調節肺腺癌轉移相關轉錄1(MALAT 1)和α-synuclein的表達，在體內和體外PD模型中發揮神經保護作用。同樣，Kim等[40]通過將α-細辛醚作用于MPTP誘導的PD小鼠模型以及以脂多糖(LPS)刺激的BV-2小膠質細胞模型，發現α-細辛醚能減輕帕金森病小鼠行為缺陷，并認為可能機制是通過抑制NF-κB而減輕小膠質細胞介導的神經炎癥實現的。

4 對癲癇的作用

癲癇(epilepsy)是大腦神經元突發性異常放電，導致短暫的大腦功能障礙以中樞神經系統功能失常為特征的一種慢性疾病。即刻早期基因c-fos作為神經功能活動的代謝產物，c-fos基因及FOS蛋白的表達被認為在癲癇發病機制中有重要作用[41]。此外，癲癇被認為是腦內興奮性神經遞質谷氨酸(glutamate，Glu)與抑制性神經遞質γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)平衡失調的結果，谷氨酸脫羧酶(GAD)是Glu脫羧形成GABA的關鍵限速酶，GAD的活性對該平衡狀態也有主要作用[42]。Fu等[43]通過β-細辛醚作用于青霉素點燃致癲癇大鼠，發現β-細辛醚能激活大鼠額葉皮質中c-fos基因從而明顯提高FOS的表達，還能夠降低谷氨酸脫羧酶GAD 65的表達，并且呈明顯的劑量-效應關系。在化學作用(N-甲基-D-天門冬氨酸、毛果蕓香堿)和電作用(最大電休克)誘導癲癇試驗中[44]，α-細辛醚能夠延緩陣攣和強直性發作，降低試驗小鼠死亡率。α-細辛醚還能夠通過增強GABA能抑制作用而抑制海馬神經元的活動，并在中樞神經系統產生抗癲癇作用[45]，上文有研究也提到α-細辛醚能夠對小鼠海馬內Glu水平產生一定的影響[18]，可以認為α-細辛醚能夠調節腦內興奮性神經遞質與抑制性神經遞質，維持二者平衡水平。所以，He等[46]認為α-細辛醚具有較好的神經保護作用和低毒性，有望成為一種新的芳香烯丙醇類抗驚厥藥物，作為抗癲癇藥物具有很大的開發潛力。

表1 α-細辛醚和β-細辛醚抗神經系統疾病作用機制Table 1 Mechanism of α-asarone and β-asarone anti-nervous system diseases

續表1(Continued Tab.1)

續表1(Continued Tab.1)

5 對腦缺血再灌注損傷的作用

腦卒中(cerebral stroke)，包括出血性卒中(腦出血)和缺血性卒中(腦梗死)，其中缺血性卒中占比約85%[47]。急性缺血性腦卒中的治療方法可分為溶栓治療和神經保護治療兩大類[48]。目前，溶栓治療藥物重組人組織型纖溶酶原激活劑(rt-PA)是FDA獲批臨床用于治療急性缺血性腦卒中、深靜脈血栓及其他血管疾病的藥物[49]。由于急性缺血性腦卒中本身是一種復雜的生理病理破壞性疾病，缺血后再灌注會引起缺血組織的繼發性損傷和功能障礙，造成更加嚴重的病理反應[50]。所以近年來，國內外研究偏向于尋找神經保護治療方法及機制探討。傳統開竅藥石菖蒲作為天然藥物，其活性物質α-和β-細辛醚在缺血再灌注損傷中發揮的顯著作用得到了國內外研究的重視。

α-和β-細辛醚憑借其揮發油特性，能夠從血液快速透過血腦屏障入腦，作用于缺血部位。研究證實[51-54]，α-細辛醚、β-細辛醚均能夠降低大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大/小鼠腦組織含水量，減輕腦水腫，減少梗死面積，降低動物死亡率以及改善神經行為學評分，對腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion，I/R)小鼠起保護作用。在體外實驗中[50,53]，也發現α-和β-細辛醚能夠改善氧糖剝奪/復糖復氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)導致的細胞凋亡與死亡，對海馬神經元細胞、星形膠質細胞均有保護作用。由于α-和β-細辛醚在改善缺血再灌注損傷相關研究有限，下文所述主要通過現已明確的改善機制與α-和β-細辛醚在急性缺血性腦卒中各級聯反應中的潛在機制結合進行討論。

5.1 通過緩解能量代謝及離子代謝障礙發揮作用

腦最為代謝最為活躍的器官，自身能量和氧儲備量最少，所以腦對缺血、缺氧損傷極為敏感[55]。腦缺血后，腦組織氧糖缺乏并引發能量代謝障礙，依靠ATP轉運的離子泵活性因能量障礙受到抑制，同時因為鉀泵、鈣泵活性降低，使大量K+，Ca2+內流，由于滲透壓作用，大量水被攝入從而導致腦水腫。研究[56]證實β-細辛醚能夠提高I/R小鼠的耐缺氧能力，增加耐缺氧死亡時間。線粒體作為為機體提供能量的來源，在缺血再灌注損傷發生時，線粒體能量代謝異常。經過β-細辛醚處理OGD/R的原代海馬神經元，JNK磷酸化水平降低，神經元線粒體內細胞色素C(Cyt C)趨于正常，從而降低caspase級聯反應誘導的細胞凋亡，對損傷海馬神經元起到了很好的保護作用[57]。當腦內ATP逐漸耗竭，能量代謝障礙會直接抑制細胞膜上Na+-K+-ATP酶活性，同時使神經元去極化，電壓依賴性與配體門控性Ca2+通道激活，造成大量Ca2+內流。Ca2+水平紊亂又可以影響線粒體內ATP生成障礙，形成惡循環，進一步加重損傷。研究[50]發現β-細辛醚作用的I/R大鼠，其海馬體中的Na+-K+-ATP酶活性顯著升高，并且在體外實驗[58,52]中也發現，β-細辛醚可以降低PC12細胞Ca2+水平以及降低線粒體膜電位，通過調節離子通道改善細胞損傷。

5.2 通過降低興奮性毒性發揮作用

Ca2+水平的升高會刺激突觸素蛋白釋放過多谷氨酸，引起谷氨酸受體過度活化，使神經元過度興奮，從而導致神經元潰變、死亡[18]。NMAD受體作為谷氨酸離子型受體，β-細辛醚能夠調節NMDA受體的表達，增強突觸素(SYN)在細胞內的表達，對谷氨酸損傷的PC12細胞有一定的保護作用[59]。另一項動物實驗[18]發現，α-細辛醚也能夠改善中樞神經系統興奮性毒性引起的神經疾病，它能夠調節Ca2+濃度，對谷氨酸受體(AMPA、NMDA)、轉運體GLT-1以及控制釋放谷氨酸的突觸素蛋白(SYN Ⅰ)來維持谷氨酸的濃度。谷氨酸作為引起興奮性神經毒性的主要神經遞質，在認知功能障礙、癲癇這兩類神經系統疾病中也有關鍵影響，所以α-細辛醚與β-細辛醚的降低興奮性毒性的作用，具有廣泛的應用領域及研究價值。

5.3 通過降低自由基氧化應激發揮作用

腦缺血時，抗氧化防御系統活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)蓄積過多，攻擊機體，參與抗氧化的內源性酶，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等引起缺血部位氧化應激[60]。有研究者[61]表示再灌注后腦內抗氧化穩態的恢復可能有助于腦缺血損傷的恢復。Yang等[51]首先通過對缺血再灌注損傷小鼠神經功能缺損評分以及握力的行為學測試，發現β-細辛醚能夠對損傷大鼠行為表現起到顯著的改善作用。其次他們通過測定內源性抗氧化酶乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽(GSH)含量、GSH-Px活性、谷胱甘肽還原酶(GR)活性、CAT以及Na+-K+-ATP酶來評估氧化應激，發現β-細辛醚能夠使各酶水平均明顯恢復。可見β-細辛醚通過增加與病變發病相關的抗氧化活性，從而增強腦缺血防御機制。Manikandan等[62]通過研究α-細辛醚對噪音引起的大鼠腦內抗氧化酶的影響，發現α-細辛醚能調節模型大鼠SOD、CAT、GSH-Px、GSH、維生素C、維生素E和蛋白質硫醇含量高低而起到有效的保護作用。

5.4 通過抑制炎性因子的表達發揮作用

氧自由基和其他信使激活炎性細胞因子，釋放趨化因子，上調黏附分子，在白細胞和內皮細胞的相互作用下，白細胞黏附于血管內皮細胞，從而阻塞微血管，導致微血管閉塞而引發“無復流現象”[63]。炎性反應作為一把雙刃劍，在病理條件下，炎性因子在協調天然和獲得性免疫反應中起關鍵作用，其引起的炎性反應對機體穩態起著保護性效應，同時過度的炎性反應又能夠損傷機體[64]。腦缺血時，氧自由基累積，炎性反應增加，激活的白細胞在微血管內聚集，釋放大量的炎性介質和細胞因子，使更多的中性粒細胞聚集到炎性反應部位，從而加重炎癥反應，造成惡性循環[65]。Chang等[66]通過研究SH-SY5Y細胞炎性反應及自噬作用，發現β-細辛醚可抑制炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的產生，保護細胞免受Aβ25-35誘導的炎性反應。α-細辛醚是一種很有前途的神經保護劑，可以用于預防和治療小膠質細胞介導的神經炎癥狀態，因為有研究[67]在體內/體外實驗中發現，α-細辛醚能夠阻斷NF-κB激酶即IκB-α和β(inhibitor kappa B-α，β)在SE大鼠和原代培養細胞中的降解途徑，調節NF-κB轉錄水平，抑制小膠質細胞介導的神經炎癥。Xu等[68]的研究結論與該研究結果相一致，另外他們認為α-細辛醚減輕炎癥是通過抑制NF-κB信號通路減少了炎性因子TNF-α、IL-1β的產生。

5.5 通過保護血腦屏障發揮作用及其他作用

上述各級聯反應的作用下，特別是在炎性反應中聚集的白細胞能夠釋放氧自由基、蛋白水解酶等直接損傷腦毛細血管內皮細胞，破壞血腦屏障。血腦屏障作為保持腦組織內環境穩定的重要屏障，中樞神經系統疾病常引起其結構與功能的變化。病理狀態下，血腦屏障的內皮細胞間緊密連接開放，使得屏障的通透性增加，從而產生腦水腫造成神經元損傷，導致腦組織嚴重破壞。有觀點[69]認為，若降低血腦屏障通透性，阻止大分子物質通過血腦屏障，將能夠保護血腦屏障，改善腦缺血再灌注損傷。雖然已有研究[70]證實石菖蒲及石菖蒲揮發油成分能夠保護血腦屏障，降低腦缺血再灌注損傷，但也有結果[71,37]表明α-與β-細辛醚能使內皮細胞皺縮，緊密連接疏松，從而增加血腦屏障的通透性，輔助藥物進入腦組織，這與上述研究機制相矛盾。所以，α-和β-細辛醚對于血腦屏障是否具有保護作用還需要進一步研究來證實。

除此之外，α-和β-細辛醚在擴張血管以及抗血栓中也發揮重要作用。有研究表明β-細辛醚和α-細辛醚都能夠抗血小板聚集[72,73]。另外，內皮素、去甲腎上腺素(NE)、降鈣素基因相關肽(CGRP)等作為調節血管的收縮與舒張的重要因子，β-細辛醚能降低內皮素含量，升高CGRP表達[74]，降低NE含量[75]。總之，α-和β-細辛醚可以通過擴張血管，降低病理條件下血小板聚集，從而使血管平滑肌舒張，改善組織血液供應，起到一定的抗血栓作用。

6 討論與展望

石菖蒲揮發油主要成分α-和β-細辛醚的藥理作用廣泛，由于其高脂溶性，它們極易通過血腦屏障分布于腦組織，在神經系統疾病方面展示了廣泛藥理活性。近年來，國內外學者對于α-和β-細辛醚作用機制進行了系統的研究，證實了它們具有抗認知功能障礙、抗抑郁、抗帕金森、抗癲癇和抗缺血性腦卒中的顯著作用。臨床已將α-細辛醚用于支氣管哮喘、慢性支氣炎、肺炎及其它呼吸道疾病的治療，其抗血小板和抗血栓作用也在冠心病、心肌梗死以及肺栓塞的治療中發揮了優勢[76]。此外，β-細辛醚通過誘導癌細胞凋亡，對結腸癌、直腸癌顯示出有效的抗腫瘤活性[77]。然而，對α-和β-細辛醚開發與應用還需要解決一系列問題。首先，α-和β-細辛醚雖然具有吸收快、分布快的特點，但它們的口服生物利用度低，血漿中藥物消除的速度快，半衰期短；其次，β-細辛醚在機體內約22%可轉變為α-細辛醚(順式結構轉變為反式結構)，使得β-細辛醚的藥理作用變得不明確；另外，毒理學研究表明，α-和β-細辛醚具有致突變性、遺傳毒性和致畸性，臨床應用具有一定風險[78,79]。因此，可以對α-和β-細辛醚進行一定的化學結構修飾來提高藥物的穩定性，改善α-和β-細辛醚的代謝過程，從而提高生物利用度；對其用藥安全及用藥劑量進行進一步評價，提高藥物作用的安全性和有效性；并且，還需要對現今有關α-和β-細辛醚致肝癌與抗癌的不同觀點進行進一步研究。總之，繼續深入開展對石菖蒲揮發油主要成分α-和β-細辛醚藥理活性等方面的研究將具有重要意義。