黃芩內(nèi)生真菌發(fā)酵黃芩苷生成千層紙素A的代謝途徑及轉(zhuǎn)化條件研究

馬宗敏，苗文麗，劉 佳，何 培，孫國強，裴 林

河北省中醫(yī)藥科學院 濁毒證重點實驗室，石家莊 050031

千層紙素A(oroxylin A，OA，5,7-dihydroxy-6-methoxy flavone，C16H12O5，結(jié)構(gòu)式見圖4)是中藥黃芩的活性組分之一，為黃酮類化合物，在黃芩中的含量約為0.05%～0.2%[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)千層紙素A具有多種藥理活性，包括抗炎[2]、抗過敏[3]、抑制病毒[4]、改善心力衰竭[5]、保護肝臟[6]、血管[7]、保護神經(jīng)細胞并改善記憶[8]、抗腫瘤[9]等。尤其是千層紙素A的抗腫瘤作用受到了廣泛關(guān)注，不斷有國內(nèi)外研究證實其對多種腫瘤細胞具有抑制作用[10,11]。千層紙素A通過誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞遷移、抑制糖酵解、自噬等途徑發(fā)揮其抗腫瘤作用[12]。同時，千層紙素A選擇性殺傷腫瘤細胞而對正常造血系統(tǒng)影響較小，這是目前腫瘤化療藥物不具備的[13]。

天然化合物活性高且毒副作用較低，但因資源有限及其特殊的立體結(jié)構(gòu)，使得天然化合物的應用受到一定限制。同樣的，雖然千層紙素A的藥效研究樂觀可期，但是千層紙素A的生產(chǎn)和單方制劑研究卻寥寥無幾[12]。千層紙素A當前的來源主要是化學提取和合成，南京某公司報道了從木蝴蝶中分離純化千層紙素A的方法[14]，通過有機溶劑提取、大孔樹脂富集和聚酰胺柱層析分離純化、重結(jié)晶后得到產(chǎn)物。該法提取得到的千層紙素A不足藥用植物本身質(zhì)量的0.1%。Majeed等[15]也報道了從一種印度藥用植物Oroxylumindicum中利用有機溶劑提取千層紙素A的方法，提取物中千層紙素A含量為10%～15%，但報道中并未提及產(chǎn)物得率。鑒于植物中千層紙素A含量低，提取成本過高且污染嚴重，而且容易破壞產(chǎn)物的天然立體結(jié)構(gòu)，對藥效造成影響[12,14,15]，因此國內(nèi)外學者也對千層紙素A的化學合成進行了研究，合成起始物包括黃芩素和黃芩苷。Li等[16]以黃芩素為起始物通過4步化學反應得到千層紙素A，Li等[17]以黃芩苷為起始物，通過甲基化和去保護基步驟得到千層紙素A，化學合成所需步驟較多，用到多種有機試劑，污染嚴重，尚無適用于大規(guī)模生產(chǎn)的方法見諸報道。微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)千層紙素A具有高效、清潔、環(huán)保的優(yōu)勢，且能最大限度保留其天然活性[18]，更容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。但對于以黃芩苷為底物通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化合成千層紙素A的研究未見報道，僅Zhang等[19]報道了利用基因工程氧甲基化轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化黃芩素生成千層紙素A，文獻主要針對酶的反應位點特異性進行研究。課題組前期從中藥黃芩植株根部篩選得到一株能夠轉(zhuǎn)化黃芩苷生成千層紙素A的內(nèi)生青霉菌Penicilliumsp.R3[20]，開發(fā)了一條千層紙素A微生物合成的新途徑。在前期工作基礎(chǔ)上，本研究明確了Penicilliumsp.R3生長的規(guī)律，對其轉(zhuǎn)化黃芩苷生成千層紙素A的途徑進行了初步探索和論證，同時采用單因素結(jié)合正交試驗法優(yōu)化了發(fā)酵轉(zhuǎn)化的條件并提高了產(chǎn)量，為千層紙素A的微生物合成及開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

菌株P(guān)enicilliumsp.R3為野生黃芩新鮮植株根部內(nèi)生青霉菌，由河北省中醫(yī)藥科學院濁毒證實驗室分離、鑒定并保藏[20]。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種活化及發(fā)酵培養(yǎng)基均為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)，孢子制備培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面。發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為PDB培養(yǎng)液滅菌后加入一定比例底物。各培養(yǎng)基詳細制備方法參考文獻[21]。

1.1.3 儀器

LS-35HD型高壓蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司)；XB.K.25型血球計數(shù)板(上海求精生化試劑儀器有限公司)；DMBA300型生物數(shù)碼顯微鏡(Motic實業(yè)集團中國有限公司)；SPX-150型生化培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；THZ-98AB型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)；DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱(中儀國科北京科技有限公司)；HP-01型無油真空泵(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；KH-300E型超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；1260型高效液相色譜儀(安捷倫公司，美國)；ELGA超純水儀(威立雅公司，英國)；CP-214型電子分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)。

1.1.4 試劑

黃芩苷對照品(北京盛世康普化工技術(shù)研究院，批號151121，純度≥99%)；黃芩素、千層紙素A對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為C02A6Y1、Y29D6Y17716，純度均≥98%)；黃芩苷、黃芩素(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為C22J7Y9309、C04D8Y49741，純度均≥90%)；色譜甲醇(Tedia公司，美國)；超純水(自制)；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備

菌種活化后劃線至PDA斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)，待斜面長滿孢子后，取出1支，加入10 mL已滅菌的生理鹽水，輕輕搖晃，充分沖洗孢子，然后在超凈工作臺中將沖洗液用無菌脫脂棉進行過濾，孢子濾液中加入無菌玻璃球，然后搖床震蕩30 min使成團的孢子打散，制備好孢子懸浮液搖勻后用血球計數(shù)板置于顯微鏡下觀察計數(shù)，計算孢子濃度[22]，并按實驗需要稀釋成所需濃度進行接種。

1.2.2 菌體培養(yǎng)及生長曲線測定

取孢子懸浮液按5%比例接種至配制好的PDB培養(yǎng)液中，28 ℃，150 rpm培養(yǎng)，于培養(yǎng)0～10天每日取出，搖勻后取10 mL，過濾得到菌體，于80 ℃烘干至恒重，稱重后計算菌體干重[22]，繪制菌體生長曲線，每日3組平行。

1.2.3 高效液相色譜法(HPLC)分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物

供試品溶液的制備[21]：發(fā)酵液超聲10 min后搖勻，取0.5 mL，加甲醇8～9 mL，超聲10 min后放至室溫，繼續(xù)精密加入甲醇至10 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾得供試品溶液。以未接種孢子的培養(yǎng)液同法處理作為空白對照。

對照品溶液的制備：精密稱取黃芩苷、黃芩素和千層紙素A對照品適量，加甲醇配成質(zhì)量濃度分別為106.4、57.80、52.10 μg/mL的混合對照品溶液。

色譜條件[21]：色譜柱 Agilent ZORBAX Eclipse plus C18(4.6×250 mm，5 μm)；紫外檢測器(VWD)；流動相為0.2 %冰醋酸甲醇溶液(A)-0.2 %冰醋酸水溶液(B)梯度洗脫(0～15 min：49%A；15～18 min：49%→61%A；18～36 min：61%A)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm，進樣量10 μL。

1.2.4 標準曲線的繪制

精密稱取“1.2.3”項下混合對照品溶液，加甲醇梯度稀釋成6個不同濃度的對照品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進行測定，每濃度進樣3次，以濃度及對應峰面積繪制標準曲線并得到線性回歸方程。

1.2.5 各成分含量及轉(zhuǎn)化率計算

各成分含量利用標準曲線所得線性回歸方程進行計算，轉(zhuǎn)化率采用產(chǎn)物與發(fā)生轉(zhuǎn)化的底物的摩爾比進行計算，計算方法參考文獻[21]。

1.2.6 轉(zhuǎn)化途徑分析

取Penicilliumsp.R3孢子懸浮液按5%比例接種至PDB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3天后各瓶分別加入0.1%黃芩苷、黃芩素和千層紙素A進行轉(zhuǎn)化實驗，每組2個平行，同時設(shè)置未接種瓶作為空白對照，轉(zhuǎn)化6天后取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液，取“1.2.3”項下對照品溶液稀釋5倍作為對照品，按“1.2.3”項下條件進行HPLC檢測，分析產(chǎn)物。

1.2.7 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化實驗

底物黃芩苷加入時間：取相同濃度的Penicilliumsp.R3孢子懸浮液，按5%比例接種至PDB培養(yǎng)液中，28 ℃，150 rpm培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)第0、1、2、3、4天時加入0.1%的黃芩苷繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

底物黃芩苷轉(zhuǎn)化時長：取相同濃度的Penicilliumsp.R3孢子懸浮液，按5%比例接種至PDB培養(yǎng)液中，28 ℃，150 rpm培養(yǎng)3天后，加入0.1%的黃芩苷分別繼續(xù)培養(yǎng)1～7天，每天取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

底物黃芩苷添加比例：取相同濃度的Penicilliumsp.R3孢子懸浮液，按5%比例接種至PDB培養(yǎng)液中，28 ℃，150 rpm培養(yǎng)3天后分別按0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%的比例加入黃芩苷繼續(xù)培養(yǎng)6天，取出，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

1.2.8 發(fā)酵條件正交優(yōu)化實驗

以單因素試驗優(yōu)化條件為基礎(chǔ)，選取裝液量(A)、轉(zhuǎn)速(B)、溫度(C)、接種量(D)為考察因素，分別以轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)液中千層紙素A的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量為考察指標，按表1進行四因素三水平正交試驗L9(34)，具體發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件為取250 mL錐形瓶為發(fā)酵容器，在相應條件下接種培養(yǎng)3天，然后按0.08%比例加入黃芩苷并進行6天的轉(zhuǎn)化實驗，發(fā)酵完成后取樣，按“1.2.3”項下方法制備供試品及空白溶液并測定黃芩苷及千層紙素A含量。

1.2.9 優(yōu)化條件驗證

按照單因素及正交實驗優(yōu)化的發(fā)酵條件進行3次重復驗證試驗，計算轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量及相應的RSD值，分析穩(wěn)定性及可行性。

2 實驗結(jié)果

2.1 菌株生長曲線

培養(yǎng)液接種孢子后于28 ℃，150 rpm培養(yǎng)，發(fā)酵菌液生長良好，由乳白色逐漸變?yōu)槟G色，細屑狀。

表1 正交因素水平L9(34)表Table 1 L9(34)orthogonal test factors and levels

由菌體生長曲線(圖1)可看出，菌體在0～1天處于停滯期，1～4天處于對數(shù)生長期，4天之后進入穩(wěn)定期，之后生物量變化不大。由于以菌體干重為標準繪制生長曲線，因此不能很好反映菌體的衰落期。但是本曲線基本符合一般微生物生長規(guī)律，正確的反映出Penicilliumsp.R3的生長情況，明確了其快速生長期，且可看出菌株生長迅速，前期生物量的迅速積累，有利于底物的轉(zhuǎn)化。菌株的生物量在第5天和第7天略有下降，在生長穩(wěn)定期，菌體處于死亡和新生的一個平衡階段，大致處于總生物量穩(wěn)定狀態(tài)，但出現(xiàn)波動是難免的。

圖1 菌株P(guān)enicillium sp.R3生長曲線Fig.1 Growth curve of Penicillium sp.R3

2.2 標準曲線

按“1.2.3”測定并繪制黃芩苷、千層紙素A標準曲線(圖2)，得到兩種物質(zhì)峰面積對應濃度的線性回歸方程，黃芩苷(Y=31.666X+5.524；R2=0.995 0)，千層紙素A(Y=58.222X+13.485；R2=0.998 2)。黃芩苷、千層紙素A分別在0.020～0.638、0.010～0.313 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于發(fā)酵液中相應物質(zhì)含量的計算。

2.3 轉(zhuǎn)化途徑分析

由HPLC譜圖(圖3)可看出，經(jīng)6天轉(zhuǎn)化反應后，菌株轉(zhuǎn)化黃芩苷得到黃芩素和千層紙素A兩種產(chǎn)物(圖B)，轉(zhuǎn)化黃芩素得到產(chǎn)物千層紙素A(圖C)，但千層紙素A未發(fā)生轉(zhuǎn)化(圖D)，相應空白均未發(fā)生轉(zhuǎn)化(圖b、c、d)，由此可證明黃芩苷在轉(zhuǎn)化過程中得到的兩種產(chǎn)物是具有相關(guān)性的，并非分別獨立轉(zhuǎn)化，這也與我們之前文章中提出的黃芩素可能為中間產(chǎn)物的設(shè)想相一致[20]。菌體先轉(zhuǎn)化黃芩苷生成黃芩素，再進一步轉(zhuǎn)化黃芩素為千層紙素A，黃芩素為中間產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化途徑見圖4，但詳盡轉(zhuǎn)化途徑和機制還需進一步深入研究。由此，明確黃芩苷經(jīng)內(nèi)生菌Penicilliumsp.R3轉(zhuǎn)化終產(chǎn)物為千層紙素A，后續(xù)將以千層紙素A為指標進行優(yōu)化條件研究。

圖2 黃芩苷(A)和千層紙素A(B)標準曲線Fig.2 Calibration curve of baicalin(A)and oroxylin A(B)

圖3 對照品、轉(zhuǎn)化樣品及空白的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of standard substances,biotransformation samples and blanks注：1.黃芩苷；2.黃芩素；3.千層紙素A。A.對照品；B.黃芩苷轉(zhuǎn)化樣品；C.黃芩素轉(zhuǎn)化樣品；D.千層紙素A轉(zhuǎn)化樣品。a.對照品；b.黃芩苷轉(zhuǎn)化空白；c.黃芩素轉(zhuǎn)化空白；d.千層紙素A轉(zhuǎn)化空白。Note:1.Baicalin;2.Baicalein;3.Oroxylin A.A.Standard substances;B.Baicalin biotransformation sample;C.Baicalein biotransformation sample;D.Oroxylin A biotransformation sample.a.Standard substances;b.Baicalin biotransformation blank;c.Baicalein biotransformation blank;d.Oroxylin A biotransformation blank.

圖4 菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化黃芩苷的生物轉(zhuǎn)化途徑Fig.4 Biotransformation pathway of bacalin by Penicillium sp.R3

2.4 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化實驗

2.4.1 底物黃芩苷加入時間

由圖5可見于培養(yǎng)0～1天加入黃芩苷，底物消耗多，千層紙素A的產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率卻不高，第2天之后加入黃芩苷，消耗率較之前降低，轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量卻有所提高，第3天加入黃芩苷，千層紙素A的轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量均為最高。結(jié)合菌體生長曲線(圖1)可知，0～1天菌體正處于吸收累積營養(yǎng)為快速生長做準備階段，此時加入黃芩苷，菌體可能將部分黃芩苷用于生長，進而導致消耗多產(chǎn)出少。第3天快速生長階段基本完成，此時加入的黃芩苷極少用于生長，轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量均提高且達到最高值。因此選取培養(yǎng)第3天為底物的最佳添加時間。

2.4.2 底物黃芩苷轉(zhuǎn)化時長

由圖6的轉(zhuǎn)化率曲線可看出，從第2天開始，轉(zhuǎn)化率變化幅度很小，隨著黃芩苷的消耗產(chǎn)物逐漸積累至底物基本消耗完成，轉(zhuǎn)化6天后，千層紙素A產(chǎn)量達到峰值，黃芩苷消耗殆盡，之后千層紙素A質(zhì)量濃度略有下降，可能是菌體進入生長衰退期引起的，具體原因還有待于進一步分析，但由此可看出轉(zhuǎn)化時間過長并不利產(chǎn)物累積，因此選取6天為添加底物后最佳轉(zhuǎn)化時長。

圖5 接種后加入黃芩苷的最適時間Fig.5 Optimal adding time of substrate after inoculation

圖6 底物發(fā)酵轉(zhuǎn)化最適時長Fig.6 Optimal transformation time of the substrate

2.4.3 底物黃芩苷添加比例

由圖7可看出，隨著黃芩苷添加量的增加，其消耗率逐漸下降，在菌體轉(zhuǎn)化率變化不大的狀態(tài)下，底物黃芩苷在一定時間內(nèi)的消耗量也是穩(wěn)定的，因此添加量越多消耗率越低，比例低于0.06%時黃芩苷可100%消耗，但耗盡后菌體尚有轉(zhuǎn)化能力底物卻不足，黃芩苷添加比例高于0.06%時，底物充足，可使菌體轉(zhuǎn)化能力得到最大利用，當黃芩苷添加量為0.08%時，轉(zhuǎn)化率最高同時千層紙素A產(chǎn)量與峰值接近，黃芩苷的利用率達到80%。綜合各因素，選取黃芩苷添加比例為培養(yǎng)液的0.08%。

圖7 底物的最適添加比例Fig.7 Optimal additive proportion of the substrate

2.5 發(fā)酵條件正交優(yōu)化實驗

單因素優(yōu)化實驗結(jié)果為接種培養(yǎng)3天后按0.08%比例加入黃芩苷，繼續(xù)轉(zhuǎn)化6天結(jié)束培養(yǎng)。以此為基礎(chǔ)按“1.2.8”方法進行正交實驗優(yōu)化，實驗結(jié)果及方差分析見下表2和3，以千層紙素A轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量為考察指標的正交試驗中(表2)，各因素對兩個指標影響的大小順序相同，均為A(裝液量)>B(轉(zhuǎn)速)>C(培養(yǎng)溫度)>D(接種孢子濃度)，針對轉(zhuǎn)化率最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為A1B3C1D2，即裝液量10%，轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)溫度25 ℃，接種孢子濃度1×106～2×106個/mL。針對產(chǎn)量最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件為A1B2C3D2，即裝液量10%，轉(zhuǎn)速150 rpm，培養(yǎng)溫度30 ℃，接種孢子濃度1×106～2×106個/mL。

以極差最小的D因素作為誤差項進行方差分析[23]，結(jié)果(表3)表明，4個因素中，裝液量對轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量均有顯著影響(P<0.05)，而其他因素并未表現(xiàn)出顯著影響，在以產(chǎn)量為考察指標的正交實驗中，轉(zhuǎn)速的顯著性P值介于0.05和0.10之間，比其他指標影響略大一些。兩指標綜合結(jié)果可看出，裝液量是主要影響因素，其次是轉(zhuǎn)速，而接種量和溫度影響并不大。

兩個考察指標的最優(yōu)條件中裝液量均為10%，接種量均為1×106～2×106個/mL，具有一致性，差別在于溫度及轉(zhuǎn)速。考慮到在產(chǎn)量為指標的正交試驗中，轉(zhuǎn)速的影響也較明顯，因此轉(zhuǎn)速采用150 rpm，在溫度控制方面，30 ℃比25 ℃在實際培養(yǎng)及后期放大培養(yǎng)中更容易穩(wěn)定控制，25 ℃需要低于20 ℃的環(huán)境溫度或有制冷功能的培養(yǎng)設(shè)備中才能良好保持，不利于環(huán)保節(jié)能及后期擴大培養(yǎng)，因此采用30 ℃為培養(yǎng)溫度。經(jīng)過正交試驗優(yōu)化最終確定的培養(yǎng)條件為裝液量10%，轉(zhuǎn)速150 rpm，培養(yǎng)溫度30 ℃，接種孢子濃度1×106～2×106個/mL。

2.6 優(yōu)化條件驗證試驗

按照單因素及正交實驗優(yōu)化的發(fā)酵條件進行3次重復驗證試驗，結(jié)果見表4，轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量穩(wěn)定性較好，3次驗證試驗轉(zhuǎn)化率的RSD=4.0%(n=3)，產(chǎn)量的RSD=4.5%(n=3)，該轉(zhuǎn)化條件是可行的。

3 結(jié)論

菌株P(guān)enicilliumsp.R3生長速度快，4天內(nèi)即達到最大生物量，有利于縮短培養(yǎng)周期，節(jié)約能源，提高產(chǎn)品生產(chǎn)效率，是一株優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。

表2 黃芩苷發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and result of fermentation process of baicalin

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

表4 Penicillium sp.R3轉(zhuǎn)化黃芩苷生成千層紙素A最優(yōu)條件驗證Table 4 Verify results of biotrasformation process from bacalin to oroxylin A by Penicillium sp.R3

在大量優(yōu)化實驗過程中我們發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物黃芩素的產(chǎn)量變化不大，但千層紙素A的產(chǎn)量隨實驗條件呈現(xiàn)明顯波動，于是推測黃芩素可能為中間產(chǎn)物，經(jīng)過研究初步驗證了此設(shè)想。黃芩素與千層紙素A僅6號位取代基不同，分別為羥基和甲氧基，推測菌株P(guān)enicilliumsp.R3極可能同時產(chǎn)生葡萄糖苷酶和甲基轉(zhuǎn)移酶兩種酶，先利用葡萄糖苷酶將黃芩苷糖苷鍵斷開生成黃芩素，進而利用甲基轉(zhuǎn)移酶將黃芩素6號位甲基化生成千層紙素A，且該甲基轉(zhuǎn)移酶很可能是能夠特異性催化黃酮6位羥基甲基化的甲基轉(zhuǎn)移酶[19]，此推測還需后續(xù)研究驗證。

考慮到多數(shù)菌株的高產(chǎn)酶階段處于生長平穩(wěn)期，我們采用了先培養(yǎng)后添加底物的發(fā)酵模式，并優(yōu)化了底物添加的時間節(jié)點及添加量，在生物量快速積累基本完成的第3天加入黃芩苷，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量明顯高于0～2天時加入。過早加入黃芩苷會因為黃芩苷部分用于菌體生長且轉(zhuǎn)化酶濃度低降低轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量。

正交試驗采用了千層紙素A轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量兩個指標相結(jié)合進行優(yōu)化。理論上轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量應為正相關(guān)，而在實際的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過程中我們發(fā)現(xiàn)這兩者呈現(xiàn)出了部分的不一致性，可能原因是在轉(zhuǎn)化反應中消耗的黃芩苷并沒有100%轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，有一部分用于菌體生長，有一部分轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物黃芩素，而轉(zhuǎn)化率是以產(chǎn)物千層紙素A的摩爾量與消耗底物黃芩苷的摩爾量之比進行計算，存在發(fā)酵液中千層紙素A產(chǎn)量高，但同時黃芩苷消耗也高，致使轉(zhuǎn)化率并不高的情況，反之亦然。兩個指標結(jié)合可盡量避免這一影響，得到最優(yōu)化條件。

利用微生物轉(zhuǎn)化黃芩苷合成千層紙素A尚未見報道，本研究以黃芩苷為底物通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化得到千層紙素A，最優(yōu)條件下的轉(zhuǎn)化率達到42.44%。有文獻報道以黃芩苷或黃芩素為起始物用化學法合成千層紙素A，總收率分別為56%和30%[16,17]，方法中均用到大量有機試劑，不利于清潔環(huán)保。Zhang等[19]報道了利用來自苔蘚的基因工程氧甲基化轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化黃芩素生成千層紙素A，實驗室條件下孵化1 h轉(zhuǎn)化率可達75%，酶催化下的生物轉(zhuǎn)化反應，足夠的酶量和轉(zhuǎn)化時間可使底物達到100%轉(zhuǎn)化，這與活體轉(zhuǎn)化是不同的。同時基因工程酶的獲取需要經(jīng)過復雜的基因擴增、轉(zhuǎn)化、產(chǎn)物表達、酶的分離純化等步驟，成本較高。本實驗采用的微生物轉(zhuǎn)化法具有成本低廉、轉(zhuǎn)化效率較高，培養(yǎng)簡單的優(yōu)勢，具有進一步的研究應用價值。

在分析了菌體的生長規(guī)律，初步明確的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化途徑并優(yōu)化了菌體發(fā)酵轉(zhuǎn)化條件之后，我們將對轉(zhuǎn)化機制進行進一步探索，包括菌體產(chǎn)生的與轉(zhuǎn)化相關(guān)的酶的種類、功效及活性。還將擴大發(fā)酵轉(zhuǎn)化規(guī)模，對產(chǎn)物進行提取分離，得到純度較高的產(chǎn)品進行下一步應用研究。