大高良姜地下根莖揮發(fā)油化學(xué)成分及體外藥理活性研究

陸廷亞，陳 琪，趙曉歌，韋 鳳，洪 怡，支 青，田民義,*

1貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院 貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心；2貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025

大高良姜Alpiniagalanga(L.) Willd.是姜科山姜屬多年生草本植物，果實(shí)入藥稱為紅豆蔻，收載于2015版《中國(guó)藥典》。其味辛，性溫，有散寒燥濕、醒脾消食之功效[1]。大高良姜地下根莖在印度、菲律賓及馬來西亞等地區(qū)可用作香料和調(diào)味品，既可食用又可藥用，用于治療糖尿病、風(fēng)濕病、哮喘、炎癥及胃痛等疾病[2-5]。大高良姜地下根莖富含揮發(fā)油，且已經(jīng)用于香水、化妝品和藥品中[5-7]。現(xiàn)代藥理研究表明，大高良姜地下根莖具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗?jié)兗翱惯^敏等藥理活性[8-13]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于大高良姜的研究主要集中在其果實(shí)部位，對(duì)其地下根莖揮發(fā)油的化學(xué)成分及體外藥理活性報(bào)道較少。所以，本實(shí)驗(yàn)主要通過分析大高良姜地下根莖揮發(fā)油的化學(xué)成分，并對(duì)其體外藥理活性進(jìn)行篩選，以期為國(guó)內(nèi)大高良姜地下根莖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫公司)；多功能酶標(biāo)儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(Thermo公司)；冷凍離心機(jī)(上海力伸科學(xué)儀器公司)；FA1104 電子分析天平(上海郎平儀器儀表有限公司)；HWS-150 恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京科偉永興儀器有限公司)；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；LDZX-30KBS 高壓滅菌鍋(上海中安醫(yī)療器械廠)；RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UV-5200紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)。

RP-MI-1640培養(yǎng)基(GIBCO公司)；二甲基亞砜(DMSO)(鼎國(guó)生物制劑有限公司)；DPPH、ABTS、α-葡萄糖苷酶、L-酪氨酸酶、乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶(美國(guó)Sigma公司)；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(上海博微生物科技有限公司)；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖培養(yǎng)基(杭州百思生物技術(shù)有限公司)；刃天青(大連美倫生物技術(shù)有限公司)；抗生素藥敏紙片(杭州微生物試劑有限公司)；實(shí)驗(yàn)所用水均為蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用大高良姜2018年12月采購(gòu)于廣西省玉林市，由貴州大學(xué)胡國(guó)雄教授鑒定為姜科山姜屬大高良姜Alpiniagalanga(L.) Willd.，標(biāo)本保存于貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心。菌株：大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)；白色念珠菌(CandidaalbicansBNCC 186335)；金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 6538P)；銅綠假單胞桿菌(PseudomonasaeruginosaCMCC (B) 49027)；枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisCMCC (B) 63501)；變形桿菌(ProteusvulgarisCMCC (B) 49027)。人肺癌細(xì)胞株A549、人白血病細(xì)胞株K562、人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3 和小鼠成纖維細(xì)胞株L929均購(gòu)于中國(guó)昆明細(xì)胞庫(kù)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 揮發(fā)油的制備

取新鮮大高良姜地下根莖，洗凈、切片、曬干、粉碎，稱取藥粉約300 g，置于5 L圓底燒瓶中，加入3 L蒸餾水，浸泡過夜，水蒸汽蒸餾5 h，收集餾出液，無水硫酸鈉除水，得到淡黃色有香氣的大高良姜根莖揮發(fā)油，提取率為0.43%，密封保存于4 ℃冰箱備用。

2.2 揮發(fā)油化學(xué)成分的GC-MS分析

GC參數(shù)設(shè)置：色譜柱選用HP-5MS(60 m×0.25 mm，0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度為70 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min升溫至180 ℃，再以10 ℃/min升溫至310 ℃，保持6 min，最終運(yùn)行時(shí)間為76 min；進(jìn)樣體積為1 μL；汽化室溫度為250 ℃；載氣為氦氣(純度為99.999%)；柱前壓為18.47 psi，載氣流量為1 mL/min，分流比為10∶1，溶劑延遲時(shí)間為6 min。

MS參數(shù)設(shè)置：離子源為EI源；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；發(fā)射電流為34.6 μA；倍增器電壓為1 847 V；接口溫度為280 ℃；質(zhì)量范圍為29～450 amu。

2.3 揮發(fā)油的抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]，稱取19.7 mg DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)加無水乙醇配制成濃度為1 mmoL/L的溶液，避光保存?zhèn)溆?。使用時(shí)將其稀釋為0.08 mmoL/L的DPPH溶液。取大高良姜地下根莖揮發(fā)油加無水乙醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。取2 mL供試品溶液與2 mL DPPH溶液置于具塞試管中，混勻后室溫避光放置30 min，在酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)定吸光度AS；同時(shí)測(cè)定2 mL供試品溶液與2 mL無水乙醇的吸光度AR，2 mL無水乙醇與2 mL DPPH 溶液的吸光度A0。以Ascorbic acid和BHT作為陽性對(duì)照藥，結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。按公式計(jì)算清除率：DPPH自由基清除率= [1-(AS-AR)/A0] × 100%。

2.3.2 清除ABTS自由基能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]，將50 mL 0.7 mmol/L ABTS(2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)溶液與 50 mL 2.4 mmol/L過硫酸鉀(K2S2O8)溶液混合，室溫避光放置12～18 h，制得ABTS儲(chǔ)備液。使用前將其用無水乙醇稀釋成工作液，使其在734 nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.70±0.02。取大高良姜地下根莖揮發(fā)油加無水乙醇溶解并配制成一定濃度的供試品溶液。取0.4 mL供試品溶液與4 mL ABTS溶液置于具塞試管中，混勻后室溫避光放置10 min，在酶標(biāo)儀734 nm處測(cè)定吸光度AS；同時(shí)測(cè)定0.4 mL供試品溶液與4 mL無水乙醇的吸光度AR，0.4 mL無水乙醇與4 mL ABTS溶液的吸光度A0。以抗壞血酸和BHT作為陽性對(duì)照藥，結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。按公式計(jì)算清除率：ABTS自由基清除率= [1-(AS-AR)/A0] × 100%。

2.4 揮發(fā)油的抗菌活性測(cè)定

2.4.1 菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、變形桿菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，白色念珠菌接種于沙氏瓊脂平板上，于37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h 活化，備用。使用時(shí)，挑取平板上形態(tài)相同的菌落，放入已滅菌的液體培養(yǎng)基中，在恒溫培養(yǎng)振蕩器中震蕩24 h，然后取一定量菌懸液逐倍稀釋后涂布到平板上，培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，按照稀釋的倍數(shù)與接種量計(jì)算含菌量。使用時(shí)，將菌懸液稀釋至所需濃度。

2.4.2 抑菌圈的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，采用濾紙片擴(kuò)散法，濾紙片大小為6 mm。先將含20 μL揮發(fā)油樣品和含20 μL(100 μg/mL)鏈霉素濾紙片輕輕放置于已均勻涂布100 μL(1×106CFU/mL)菌液的固體培養(yǎng)基上。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察菌的生長(zhǎng)情況，測(cè)量抑菌圈的直徑，結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。

2.4.3 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，在96孔培養(yǎng)板中，首先每孔加入100 μL的半倍稀釋的樣品和對(duì)照品溶液，然后每孔加入100 μL菌液(1×106CFU/mL)。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL(0.1 mg/mL)刃天青顯色劑，繼續(xù)放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，觀察結(jié)果，記錄數(shù)據(jù)。以微孔中顏色變化指示菌株抑制情況，以藍(lán)色孔的最小樣品濃度為MIC。從藍(lán)色孔濃度樣品取出100 μL，均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，未出現(xiàn)菌落的最小樣品濃度即為MBC值，結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。試驗(yàn)所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

2.5 揮發(fā)油的抗腫瘤活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，選用對(duì)數(shù)期的貼壁細(xì)胞，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基配制細(xì)胞懸液，80 μL接種于96孔板，密度為5×104個(gè)/mL，培養(yǎng)24 h。將待測(cè)樣品和陽性對(duì)照用DMSO溶解后，用培養(yǎng)基稀釋成5個(gè)濃度梯度。每孔加入20 μL樣品溶液，陰性對(duì)照組為等體積的培養(yǎng)基，每組設(shè)5個(gè)平行孔，培養(yǎng)72 h后，加10 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)4 h。取出96孔板，吸掉培養(yǎng)基上清液。加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使DMSO完全溶解MTT反應(yīng)的產(chǎn)物。用酶標(biāo)儀讀取490 nm波長(zhǎng)下的OD值，結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。抑制率的計(jì)算公式如下：細(xì)胞株抑制率= [1-(樣品組OD值-調(diào)零孔OD值)/(對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)] × 100%。

2.6 揮發(fā)油的酶抑制活性測(cè)定

2.6.1 酪氨酸酶抑制活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，以L-酪氨酸為底物測(cè)定酪氨酸酶的活性，以熊果苷(arbutin)為陽性對(duì)照，在96孔板上進(jìn)行活性檢測(cè)。反應(yīng)體系為：先加入70 μL樣品溶液，再加入100 μL酪氨酸酶(100 U/mL)，37 ℃恒溫孵育5 min，然后加入80 μL底物(5.5 mmol/L)，37 ℃恒溫孵育30 min，在492 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A值)。樣品組A1、樣品空白組A2、陰性組A3、空白組A4、結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。抑制率的計(jì)算公式如下：酪氨酸酶抑制率= [1-(A1-A2)/(A3-A4)] × 100%。

2.6.2α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷為底物測(cè)定α-葡萄糖苷酶的活性，以阿卡波糖(acarbose)為陽性對(duì)照，在96孔板上進(jìn)行活性檢測(cè)。反應(yīng)體系為：60 μL緩沖液(pH=6.8)中加入30 μL一定濃度的樣品溶液，加入10 μLα-葡萄糖苷酶(0.8 U/mL)，37 ℃恒溫孵育15 min，然后加入10 μL底物(1 mmol/L)，37 ℃恒溫孵育15 min，再加入80 μL碳酸鈉溶液(0.2 mol/L)終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A值)。樣品組A1、樣品空白組A2、陰性組A3、空白組A4，結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。抑制率的計(jì)算公式如下：α-葡萄糖苷酶抑制率= [1-(A1-A2)/(A3-A4)] × 100%。

2.6.3 乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，以碘代乙酰膽堿為底物測(cè)定乙酰膽堿酯酶的活性，以硫代丁酰膽堿為底物測(cè)定丁酰膽堿酯酶的活性，以加蘭它敏(galanthamine)為陽性對(duì)照，在96孔板上進(jìn)行活性檢測(cè)。反應(yīng)體系為：先加入50 μL一定濃度的樣品溶液，再加入10 μL 乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶(0.5 U/mL)，4 ℃恒溫孵育10 min，然后加入20 μL底物(2 mmol/L)和20 μL顯色劑二硫代雙硝基苯甲酸(2 mmol/L)，37 ℃恒溫孵育30 min，再加入20 μL獨(dú)扁豆堿溶液(0.018 mmol/L)終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值(A值)。樣品組A1、樣品空白組A2、陰性組A3、空白組A4，結(jié)果重復(fù)三次，取平均值。抑制率的計(jì)算公式如下：乙(丁)酰膽堿酯酶抑制率= [1-(A1-A2)/(A3-A4)] × 100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

大高良姜地下根莖揮發(fā)油的總離子流圖見圖1，對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist 2017和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定了116種揮發(fā)性化學(xué)成分，占揮發(fā)油總量的94.12 %，用峰面積歸一化進(jìn)行定量分析，計(jì)算出各個(gè)化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見如表1。

圖1 大高良姜地下根莖揮發(fā)油GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from the rhizome of A.galanga

表1 大高良姜地下根莖揮發(fā)油化學(xué)成分及相對(duì)含量Table 1 Chemical compositions and relative contents of the essential oil from the rhizome of A.galanga

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3.2 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的抗氧化活性

由表2可知，大高良姜地下根莖揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基顯示出較差的抗氧化活性，其IC50值為6 886.01±88.64 μg/mL，抗壞血酸當(dāng)量為0.09±0.02 mg AEs/g oil。對(duì)ABTS自由基有一定的抗氧化活性，其IC50值為222.8±7.04 μg/mL，抗壞血酸當(dāng)量為4.83±0.31 mg AEs/g oil。

3.3 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的抗菌活性

由表3、4可知，大高良姜地下根莖揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性，其抑菌圈大小在9.81～14.95 mm之間，MIC值在312.50～625.00 μg/mL之間，MBC值在625.00～1 250.00 μg/mL之間。揮發(fā)油對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和白色念珠菌的活性較差。

表2 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of the essential oil from the rhizomes of A.galanga

表3 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的抑菌圈直徑Table 3 Diameter of the inhibition zones of the essential oil from the rhizomes of A.galanga

表4 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度Table 4 MIC and MBC values of the essential oil from the rhizomes of A.galanga

3.4 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的抗腫瘤活性

由表5可知，大高良姜地下根莖揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其對(duì)A549、K562和PC-3腫瘤細(xì)胞的IC50值(IC50值分別為：26.57±0.76、58.01±0.94和35.56±0.57 μg/mL)與正常細(xì)胞(IC50=76.25±1.04 μg/mL)相比具有顯著性差異(P<0.05)，選擇性指數(shù)(正常細(xì)胞IC50值與腫瘤細(xì)胞的IC50值的比值)分別為2.87、1.31和2.14。

表5 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的抗腫瘤活性Table 5 Anticancer activity of the essential oil from the rhizomes of A.galanga

3.5 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的酶抑制活性

酪氨酸酶是催化黑素生成的關(guān)鍵酶，因此，酪氨酸酶抑制劑具有皮膚美白效果；α-葡萄糖苷酶抑制劑通過延緩碳水化合物在小腸的吸收，從而降低餐后血糖和胰島素水平，用于治療2型糖尿病；膽堿酯酶抑制劑通過抑制乙酰膽堿的分解，增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)傳遞，已成為阿爾茨海默病最有效的治療策略[15]。由表6可知，大高良姜地下根莖揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶、α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶表現(xiàn)出一定的酶抑制活性，其IC50分別為2 479.15±73.58、933.71±0.46、380.47±0.55和9 157.26±26.29 μg/mL，陽性當(dāng)量值分別為71.88±2.33 mg AREs/g oil、0.25±0.002 mmoL ACEs/g oil、0.77±0.02 mg GALAEs/g oil和0.52±0.01 mg GALAEs/g oil。

表6 大高良姜地下根莖揮發(fā)油的酶抑制活性Table 6 Enzyme inhibitory activity of the essential oil from the rhizomes of A.galanga

4 討論

從大高良姜地下根莖揮發(fā)油中共分析鑒定出116種化合物，占揮發(fā)油總量的94.12%，主要成分有1，8-桉葉油素(25.41%)、β-沒藥烯(6.24%)和β-倍半水芹烯(9.08%)。文獻(xiàn)回顧表明[3-5,7]，印度產(chǎn)大高良姜地下根莖揮發(fā)油富含1，8-桉葉油素(28.4～63.4%)，馬來西亞產(chǎn)大高良姜地下根莖揮發(fā)油富含1，8-桉葉油素(40.5%)、β-沒藥烯(8.4%)，對(duì)比說明產(chǎn)地對(duì)其化學(xué)成分的含量有一定影響。揮發(fā)油對(duì)ABTS自由基有一定的清除活性，對(duì)DPPH自由基顯示出較差的清除活性。揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和變形桿菌表現(xiàn)出較好的抗菌活性。揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，與正常細(xì)胞相比具有顯著性差異(P<0.05)，選擇性指數(shù)分別為2.87、1.31和2.14。揮發(fā)油對(duì)酪氨酸酶、α-葡萄糖苷酶、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶均表現(xiàn)出一定的酶抑制活性。1，8-桉葉油素已被證明具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗炎、鎮(zhèn)痛活性和乙酰膽堿酯酶抑制作用[16-18]。β-沒藥烯具有抗菌和抗腫瘤活性[19,20]。故揮發(fā)油的抗氧化、抗菌、抗腫瘤和酶抑制活性可能是這些主要的化學(xué)成分，或主要成分和少量成分的協(xié)同作用。研究結(jié)果可為大高良姜地下根莖揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供一定的數(shù)據(jù)參考。