陜西商洛艾葉精油和醇提物成分分析及其抗菌抗氧化活性研究

路 露，姚 琪，束成杰，姜洪芳，朱 凱，石寶俊*

1南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，南京 210008；2南京野生植物綜合利用研究院 南京 211100

艾(學(xué)名：ArtemisiaargyiLevl.et Vant.)是菊科蒿屬植物，現(xiàn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》[1]。艾葉既可如《食療本草》[2]中記錄“春月采嫩艾作菜食，或和面作如彈子”當(dāng)作食物使用，又可如《五十二病方》[3]中所述進(jìn)行艾熏、艾灸的藥用使用。研究表明，艾葉有抗菌抗病毒[4,5]、抗凝血[6]、抗過(guò)敏[7]、殺蟲(chóng)[8]等作用。植物揮發(fā)油由于具有由于其對(duì)人畜無(wú)副作用且對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此人們往往注重其作為天然殺菌劑、殺蟲(chóng)劑和抗氧化劑的作用[9]。

Nuerbiye等[10]發(fā)現(xiàn)了艾葉揮發(fā)油對(duì)5真菌(疫霉、黑曲霉、粉紅聚端孢、青霉、鏈格孢)的抑菌率為15.2%～74.5%。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)艾葉水提液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和乙型傷寒沙門(mén)氏菌均有抑制和殺滅作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最佳。目前很少有人研究艾葉醇提物對(duì)枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌和白色念珠菌的抑菌活性。由于傳統(tǒng)合成的抗氧化劑如叔丁基對(duì)羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等具有一定的毒副作用，因此無(wú)毒安全的天然抗氧化劑受到了重視[12,13]。本文通過(guò)GC-MS對(duì)艾葉精油成分分析，并比較了艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)5種常用菌種的抑菌效果，選取了革蘭氏陽(yáng)性菌：金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌；革蘭氏陽(yáng)性菌：大腸桿菌、綠膿桿菌；真菌：白色念珠菌為代表，探索其對(duì)不同性質(zhì)菌種的抑制效果。同時(shí)研究了二者的DPPH的清除效果。以期為艾葉的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

艾葉為陜西省商洛洛南縣古城鎮(zhèn)秦之艾；DPPH、抗壞血酸(Vc)(上海麥克林公司)；氯化鈉、葡萄糖、酵母抽提物(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；瓊脂、多聚蛋白胨(日本制藥株式會(huì)社)。

1.1.2 培養(yǎng)基與菌種

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌由南京野生植物資源綜合利用研究院提供。

LB培養(yǎng)基：1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母抽提物、1 g氯化鈉、2 g瓊脂、100 mL蒸餾水；LB液體培養(yǎng)基去除瓊脂即可；YPD培養(yǎng)基：1 g酵母抽提物、2 g蛋白胨、2 g葡萄糖、2.5 g瓊脂、100 mL蒸餾水YPD液體培養(yǎng)基去除瓊脂即可。以上培養(yǎng)基均進(jìn)行高壓滅菌(121 ℃，20 min)后備用。

1.1.3 儀器

Agilent Technologies 7820A氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫公司)；MQT-60R震蕩培養(yǎng)箱(上海旻泉儀器有限公司)；HCB-1300V垂直層流潔凈工作臺(tái)(青島海爾特種電器有限公司)；JW-2017HR高度冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；YP3002電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)。T6紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

1.2 樣品制備

1.2.1 艾葉精油制備

參考Nuerbiye等[10]的實(shí)驗(yàn)方法，稍加修改。稱取200 g艾葉置于圓底燒瓶中，加入3 500 mL水，然后連接揮發(fā)油提取器，加熱煮沸提取約6 h左右，用指形管接收得到綠色艾葉精油，貼標(biāo)簽保存?zhèn)溆谩Ｖ貜?fù)以上實(shí)驗(yàn)多次，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 艾葉醇提物制備

參考Guo等[14]的實(shí)驗(yàn)方法，稍加修改。稱取30 g艾葉置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入300 mL 85%的乙醇，加熱約1.5 h。待儀器冷卻后用紗布過(guò)濾倒出醇提液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，而后用離心機(jī)離心15 min，最終得到1 g/mL的艾葉醇提物，貼標(biāo)簽放冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 GC-MS成分分析條件

色譜條件為：色譜柱19091J-433-HP-5(30 m × 250 μm，0.25 μm)，初溫60 ℃，保留時(shí)間為3 min，以1 ℃/min升溫至80 ℃，保留0 min，然后以10 ℃/min升溫至180 ℃并保留2 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度為280 ℃；以氦氣為載氣，流速1 mL/min，樣量為1 μL[15]。

質(zhì)譜條件為：EI離子源200 ℃，四級(jí)桿150 ℃；電子能量70 eV；全程掃描。

1.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

1.4.1 測(cè)定抑菌圈

參考先前研究[16，17]的方法，將已滅菌的固體培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，供試菌種均勻的涂布在培養(yǎng)基上，靜置10 min。已滅菌的6 mm抑菌圈放置在培養(yǎng)基上，取10 μL樣品打在抑菌圈上。靜置10 min，DMSO作為對(duì)照。放置培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量其抑菌直徑，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.2 測(cè)定MIC、MBC

參考Wei等[18]的方法，采用雙倍稀釋法，用DMSO將樣品稀釋成31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.24 mg/mL溶液液備用。取5 mL液體培養(yǎng)基、500 μL不同濃度樣品和500 μL菌液加入到試管中，充分混勻。試管置于37 ℃，180 rpm搖床培養(yǎng)24 h。以肉眼不見(jiàn)渾濁的最低濃度即為MIC。取50 μL混合菌液于培養(yǎng)皿上，均勻涂布，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌體繁殖的最低濃度即為MBC。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 DPPH清除率的測(cè)定

DPPH方法是根據(jù)氫的提供或自由基清除能力所確定物質(zhì)的抗氧化活性[19]。參考Khawla等[20]的方法測(cè)定艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)DPPH的清除效果，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)男薷摹Ｅ渲?×10-4mol/L DPPH乙醇溶液和濃度為1、2、4、8、16、32 mg/mL的艾葉精油和艾葉醇提物以及20、40、60、80、100 mg/L的Vc溶液。分別取2 mL不同濃度的樣品和2 mL DPPH乙醇溶液。混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)其吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)3次。使用下式計(jì)算其清除率。

I=[1-(A1-A2)/A0] ×100%

式中，I：清除率；A0：DPPH加乙醇空白組吸光度；A1：樣品加DPPH吸光度；A2：樣品加乙醇的吸光度。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

本文中所有實(shí)驗(yàn)用SPSS 25數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),平行三次。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 GC-MS 分析

采用峰面積歸一化法得到各組分的相對(duì)含量。由圖1和表1可知艾葉精油的主要成分為桉葉油醇(21.11%)、萜品烯(7.24%)、龍腦(10.77%)、石竹烯(5.85%)和異香橙烯環(huán)氧化物(6.61%)。圖2和表2可知艾葉醇提物的主要成分為2-甲基四氫噻吩(20.18%)、異硫氰酸乙酯(10.47%)、二乙二醇二乙酸酯(10.06%)、2-[2-[2-(2-丁氧基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酸乙酯(7.83%)和新癸酸(6.71%)。由此可見(jiàn)二者的主要成分具有很大的差異。

圖1 艾葉精油(A)和艾葉醇提物(B)總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) of volatile oil (A) and alcohol extract(B) from A.argyi

表1 艾葉精油的化學(xué)組分Table 1 Chemical groups of A.argyi volatile oil

續(xù)表1(Continued Tab.1)

表2 艾葉醇提物的化學(xué)組分Table 2 Chemical groups of alcohol extract from A.argyi

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.2 艾葉精油和艾葉醇提物抑菌效果

不同濃度艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌生長(zhǎng)抑菌圈直徑大小見(jiàn)表3和表4。由表3和表4可知隨著艾葉精油和艾葉醇提物濃度的增加，抑菌圈大小成正比的增大。由表3可知艾葉精油對(duì)5種菌種菌具有一定的抑制效果，其中對(duì)白色念珠菌抑菌作用最佳。由表4可知艾葉醇提取對(duì)5種菌種菌具有一定的抑制效果，其中對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用最佳。結(jié)果顯示艾葉精油和艾葉醇提物的抑菌效果與其濃度呈正相關(guān)性，且艾葉精油的抑菌效果更佳。

表3 不同濃度艾葉精油抑菌圈直徑Table 3 Diameter of inhibition zone of different concentrations of A.argyi essential oil

不同菌種對(duì)不同濃度艾葉精油和艾葉醇提物的敏感度不同(表5)，艾葉精油濃度為1.95 mg/mL時(shí)，枯草芽孢桿菌不生長(zhǎng);艾葉精油濃度為3.91 mg/mL時(shí)；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌不生長(zhǎng)；艾葉醇提物濃度為3.91 mg/mL時(shí)，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌不生長(zhǎng)；艾葉精油濃度為7.81 mg/mL時(shí)，白色念珠菌和綠膿桿菌不生長(zhǎng)；艾葉醇提物濃度為7.81 mg/mL時(shí)，白色念珠菌和金黃色葡萄球菌不生長(zhǎng)；艾葉醇提物濃度為15.63 mg/mL時(shí)，綠膿桿菌不生長(zhǎng)。

表4 不同濃度艾葉醇提物抑菌圈直徑Table 4 Diameter of inhibition zone of different concentrations of alcohol extract from Artemisia argyi

表5 最小抑菌濃度結(jié)果Table 5 Results of minimum inhibitory concentration

由表6可知，艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)5種菌種的生長(zhǎng)都有不同程度的抑制作用，其中艾葉精油對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制效果較佳，其MIC/MBC值分別為1.95、7.81 mg/mL和3.91、7.81 mg/mL。艾葉醇提物對(duì)枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，MIC/MBC值分別為3.91、7.81 mg/mL和3.91、15.63 mg/mL。對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和綠膿桿菌的抑菌效果次之。其中艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)綠膿桿菌的抑菌效果較差。

2.3 艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)DPPH的清除效果

圖2為不同濃度艾葉精油、艾葉醇提物以及Vc對(duì)DPPH的清除率變化曲線圖。由圖2可知艾葉精油、艾葉醇提物對(duì)DPPH的清除率隨著濃度的增加而增大，具有正相關(guān)性。當(dāng)濃度為32 mg/mL時(shí)，艾葉精油、艾葉醇提物對(duì)DPPH的清除能力分別達(dá)到89.5%和77.6%。其清除DPPH能力分別是100 mg/L Vc的1.46和1.27倍。由此可知艾葉精油和艾葉醇提物均具有良好的抗氧化活性，艾葉精油抗氧化活性強(qiáng)于艾葉醇提物。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)水蒸氣蒸餾法從艾葉片中得到艾葉精油，并通過(guò)GC-MS分析發(fā)現(xiàn)其主要成分為桉葉油醇(21.11%)、萜品烯(7.24%)、龍腦(10.77%)、石竹烯(5.85%)和異香橙烯環(huán)氧化物(6.61%)。Wang等[21]通過(guò)水蒸氣蒸餾法提取的膠東沿海地區(qū)艾蒿精油，主要成分為桉油醇(24.54%)、石竹烯(11.57%)、樟腦(9.16%)、刺柏烯(7.87%)、長(zhǎng)葉烯(5.30%)；Bao等[22]提取的黑龍江艾葉精油主要成分為4-萜烯醇(18.75%)、6-芹子烯-4-醇(11.74%)、桉油醇(9.10%)、石竹烯氧化物(8.01%)、香芹醇(6.27%)、3，3，6-三甲基-1，4-庚二烯-6-醇(5.21%)。與之相比，桉葉油醇(21.11%)和龍腦(10.77%)含量較高，這可能是由于地區(qū)的不同導(dǎo)致的差異性。

表6 艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)5種菌種的最低抑菌濃度和最小殺菌濃度Table 6 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of essential oil andalcohol extract of Artemisia argyi against 5 species of bacteria (mg/mL)

圖2 艾葉精油、艾葉醇提物(A)和Vc(B)對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.2 DPPH· radical scavenging ability of essential oil,alcohol extract of Artemisia argyi (A) and Vc (B)

本文通過(guò)對(duì)比艾葉精油和艾葉醇提物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的抑菌效果進(jìn)行比較，均發(fā)現(xiàn)艾葉精油的效果優(yōu)于艾葉醇提物。這可能與揮發(fā)油中高含量成分桉葉油醇和龍腦有關(guān)，研究表明桉葉油醇和龍腦具有較好的鎮(zhèn)痛、抑菌和殺菌作用[19-23]。此外，Zhu等[24]發(fā)現(xiàn)美花紅千層具有很好的抑菌效果，可能是由于其成分紅桉葉油醇(50.67%)、α-蒎烯(19.27%)、2-莰烯(7.85%)含量較高。此外，我們還發(fā)現(xiàn)艾葉精油清除DPPH效果也優(yōu)于艾葉醇提物，當(dāng)二者濃度為32 mg/mL時(shí)，前者的抗氧化能力是后者的1.15倍。Cao等[25]曾發(fā)現(xiàn)β-石竹烯增加了SOD含量,降低了MDA水平，提高了其抗氧化活性。由此可知艾葉精油具有良好的抗氧化效果可能歸功于其主要成份石竹烯。

綜上所述，艾葉精油和艾葉醇提物的抑菌效果與其濃度具有正相關(guān)性，抑菌圈、MIC和MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示艾葉精油的抑菌效果優(yōu)于艾葉醇提物。從對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌5種菌種的抑制效果來(lái)看艾葉精油和艾葉醇提物均對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制效果最佳,其MIC/MBC值分別為1.95、7.81 mg/mL和3.91、7.81 mg/mL。DPPH清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知艾葉精油和艾葉醇提物均有良好的抗氧化能力，且前者優(yōu)于后者。在接下來(lái)的研究中需進(jìn)一步探索主要成分與抗菌活性和抗氧化活性之間存在的關(guān)系，為艾葉的開(kāi)發(fā)利用提供可靠的依據(jù)。