蟲草素對(duì)Aβ聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病動(dòng)物模型的保護(hù)作用及機(jī)制

王金秀，宋 皓，霍鑫華，周志鋒，郭 盛，文伊倩，肖 鵬，姚麗華,3*

1江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330013；2華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州510631；3江西固本生物科技有限公司，南昌 330096

阿爾茨海默病以突觸丟失、漸進(jìn)性神經(jīng)元死亡及認(rèn)知功能和膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)衰退為主要神經(jīng)病理特征[1]，是一種在老年人中最為常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其主要臨床表現(xiàn)為記憶障礙、行為障礙和情緒障礙。AD患病人數(shù)隨著社會(huì)人口老齡化程度不斷加劇而逐年增多。據(jù)預(yù)測，到2050年，患癡呆癥的人數(shù)將達(dá)到1.52億，是目前患病人數(shù)的三倍多[2]。目前，此病的藥物治療仍處于初級(jí)階段，并不能延緩疾病的發(fā)展，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。該病的防治已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。

在眾多病因?qū)W說中，β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚積形成可溶性Aβ二聚體后，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能進(jìn)行性退化，是目前公認(rèn)的主要發(fā)病機(jī)制之一[3-5]。Aβ寡聚體在腦內(nèi)的過度沉積會(huì)產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，引發(fā)突觸功能障礙[5]和神經(jīng)元凋亡，使腦組織發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，將進(jìn)一步加重AD病理發(fā)展[3]。有研究表明，Aβ25-35保留了Aβ的大部分物理和生物特性，被認(rèn)為是Aβ發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的主要活性片段，海馬區(qū)域注射Aβ25-35可誘發(fā)神經(jīng)元損傷，明顯降低動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)和記憶能力[6]。D-半乳糖會(huì)引起代謝紊亂，提高體內(nèi)自由基水平，加速免疫器官老化，所引起亞急性衰老與正常老化相似[7]。另外，已有研究證明，皮下注射D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型，其病理特征為進(jìn)行性記憶障礙、APP及Aβ表達(dá)增高、中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)退行性變、過度氧化應(yīng)激等[8,9]。因此，為更真實(shí)可靠地模擬阿爾茨海默病的癥狀，本實(shí)驗(yàn)采用一種比較理想且模擬程度較高的AD造模方法，即海馬區(qū)注射Aβ25-35誘發(fā)記憶障礙聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖加速動(dòng)物衰老的方法建立復(fù)合型AD動(dòng)物模型[10,11]。

蟲草素(cordycepin)分子結(jié)構(gòu)為3′-脫氧腺苷，是從蛹蟲草中分離的腺苷類似物，具有抗腫瘤，抗衰老，抗白血病等藥理作用。已有研究證實(shí)，蟲草素通過降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在突觸前的釋放來抑制興奮性突觸傳遞[12]，選擇性地抑制VGSC活性，降低Ca2+通道的開放程度[13]，改善神經(jīng)元膜去極化和神經(jīng)元過度活躍[14]，起到對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理及病理過程的調(diào)控作用。初步研究表明蟲草素類似物可以通過抗氧化作用改善D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型的反應(yīng)遲鈍和認(rèn)知障礙[15]。另外，蟲草素可以有效抑制神經(jīng)元過度興奮，延緩缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[16]，降低Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)元興奮性毒性[13]，減少缺血/再灌注導(dǎo)致的腦部損傷，改善缺血誘導(dǎo)的海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損傷及認(rèn)知障礙[17]。目前已有研究將蟲草素用于治療老年癡呆，但我們對(duì)蟲草素改善AD學(xué)習(xí)記憶障礙的神經(jīng)藥理學(xué)機(jī)制仍知之甚少。本研究將采用電刺激Y型迷宮實(shí)驗(yàn)、生化檢測并結(jié)合HE組織染色觀察方法來探討蟲草素對(duì)神經(jīng)元保護(hù)及改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用，為蟲草素在神經(jīng)系統(tǒng)的開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

腦立體定位儀(正華生物儀器設(shè)備公司)；Multiscan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Lab Systems，USA)；恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；5804R型離心機(jī)(Eppendorf，Germany)；電子天平(Mettler Toledo(上海))。

1.2 藥品與試劑

BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；乙酰膽堿酯酶(AChE)測試盒 (購自Solarbio，北京，中國)；D-半乳糖(Sigma，USA)溶于超純水中儲(chǔ)存于冰箱4 ℃；β-淀粉樣蛋白(Aβ25-35)(Sigma，USA)用超純水稀釋為4 mM母液，37 ℃老化7天，置于-20 ℃條件下備用；蟲草素由華南師范大學(xué)提供[14]，標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解，置于冰箱-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其環(huán)境

成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(7～10周齡，體重200～250 g)，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2013-0004。置于溫度22±3 ℃、濕度55%±5%、周期為每12 h明暗交替一次的清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，每天8∶00～20∶00允許動(dòng)物自由取水、取食。

2 方法

2.1 分組、給藥、造模

在實(shí)驗(yàn)前給予所有成年雄性SD大鼠一周的時(shí)間來適應(yīng)新的環(huán)境。挑選健康大鼠(將反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)緩慢或?qū)﹄姶碳み^度敏感的大鼠篩出淘汰)隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(11只)、蟲草素給藥組(11只)。模型組和蟲草素給藥組每天注射一次D-半乳糖(120 mg/kg)，空白對(duì)照組每天注射等量的無菌生理鹽水(0.9%)，連續(xù)注射40天。在連續(xù)注射25天后，給藥組開始灌胃蟲草素(蟲草素灌胃濃度10 mg/kg參考團(tuán)隊(duì)之前的研究[17])，對(duì)照組和模型組灌胃等量的無菌生理鹽水(0.9%)，每天一次，連續(xù)灌胃15天。

連續(xù)注射D-半乳糖40天后，第41天注射4 μM/L的Aβ25-35[10,11]。用10%水合氯醛(0.3 g/kg)麻醉SD大鼠，去除頭頂毛發(fā)，手術(shù)及其周圍部位用碘伏消毒后，將其固定在腦立體定位儀上，保持顱骨水平。劃開大鼠頭部皮膚，剝離顱骨表面結(jié)締組織，暴露前囟。以前鹵點(diǎn)(Bregma)為0點(diǎn)，用顱骨鉆沿0點(diǎn)向后3 mm，中線向右2 mm鉆孔。當(dāng)顱骨出現(xiàn)裂縫時(shí)，用微量注射器的針頭小心挑破。微調(diào)微量注射器(5 μL規(guī)格)位置與鉆孔位置相同，將連接微玻管的注射針緩慢下移3.5 mm。Aβ25-35溶液(模型組、給藥組)或生理鹽水溶液(對(duì)照組)于10 min內(nèi)注射完畢，留針8～10 min以確保藥物完全分散。在上述試驗(yàn)24 h后，每只大鼠被編碼一個(gè)數(shù)字，在一個(gè)黑暗的房間里進(jìn)行Y迷宮測試。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加客觀，注射、灌胃、立體腦定位和行為學(xué)測試分別由不同的人進(jìn)行。

2.2 Y型迷宮測試

Y型迷宮測試廣泛應(yīng)用于功能減退、趨向性、空間工作記憶等研究領(lǐng)域。在本實(shí)驗(yàn)中，用其評(píng)估蟲草素對(duì)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響[14,15]。Y型迷宮由三個(gè)相等的徑向臂組成(長度：30cm；角度：120)，每個(gè)臂裝有一盞15 W的燈照明，底部由電柵臂鋪設(shè)，可以通電刺激(40 V交流電，亮燈5 s后開始)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，亮燈的臂沒有電流刺激為安全區(qū)，另兩支臂黑暗且有電擊為電擊區(qū)，安全區(qū)和電擊區(qū)每隔25～35 s隨機(jī)轉(zhuǎn)變。在實(shí)驗(yàn)前，大鼠被允許自由探索Y型迷宮的三支手臂3～5 min。隨后，訓(xùn)練其在10 s內(nèi)選擇進(jìn)入安全區(qū)，進(jìn)入電擊區(qū)則被記錄為識(shí)別錯(cuò)誤，在10 s內(nèi)未進(jìn)入下一個(gè)區(qū)域同樣記錄錯(cuò)誤。兩次測試之間用75%的乙醇擦洗Y型迷宮內(nèi)部，以消除異味。每只大鼠每天進(jìn)行20次測試，持續(xù)9～13天。正確反應(yīng)率[17]和動(dòng)物反應(yīng)時(shí)間(潛伏期)[18]作為動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的評(píng)估指標(biāo)。90%的正確率為學(xué)習(xí)達(dá)標(biāo)[17]。在訓(xùn)練階段，亮燈5 s后至進(jìn)入新臂的時(shí)間被用來評(píng)估大鼠空間短時(shí)記憶。大鼠在5 s內(nèi)(未施加電刺激)進(jìn)入下一個(gè)區(qū)域，則記錄其反應(yīng)時(shí)間為0 s。

2.3 生化檢驗(yàn)

Y型迷宮行為學(xué)測試實(shí)驗(yàn)全部完成后，每組大鼠(n=5～7)用10%水合氯醛深度麻醉后進(jìn)行解剖實(shí)驗(yàn)。在碎冰上快速剝離海馬組織并稱重，在低溫裂解緩沖液(pH 7.4)中制備勻漿，冷凍離心(4 ℃，12 000 rpm，10 min)，吸取上清液，按AChE試劑盒說明書上的方法，在412 nm處測定二硫?qū)ο趸郊姿?DTNB)與碘化乙酰硫代膽堿酶解生成的TNB生成量，用其評(píng)估AChE活性。根據(jù)BCA蛋白試劑盒說明書上的方法，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，Bradford法測定蛋白濃度。結(jié)合以上兩種方法即可計(jì)算AChE活性(U/mg prot)。

2.4 HE染色

Y型迷宮行為學(xué)測試實(shí)驗(yàn)全部完成后，將每組剩余大鼠深度麻醉，開胸暴露心臟，用8號(hào)針頭經(jīng)左心室刺入主動(dòng)脈，先快速灌注200 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.4，4 ℃)，再灌注200 mL 4%多聚甲醛溶液(溶解于PBS，4 ℃)固定，直至肢體抽搐變硬。斷頭取腦，將腦浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定保存(4 ℃)，用石蠟包埋海馬，制成5 μm厚度切片，后經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察拍照。從每個(gè)大腦中選擇4～5片進(jìn)行分析。每個(gè)切片同一個(gè)平面范圍內(nèi)腦組織神經(jīng)元受損情況重復(fù)分析兩次[13]。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析都通過SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，統(tǒng)計(jì)計(jì)算數(shù)據(jù)均以均值± SD表示。采用雙因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 蟲草素對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

如圖1所示，3組大鼠在前兩天測試中正確反應(yīng)率并無很大差異，在訓(xùn)練后第3天，正常對(duì)照組和蟲草素給藥組大鼠正確率明顯提高，甚至有些大鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。在訓(xùn)練后第4天到第10天，模型組正確反應(yīng)率增長緩慢，明顯低于正常對(duì)照組與蟲草素給藥組。訓(xùn)練3天后，模型組大鼠每天的正確反應(yīng)率均明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。在訓(xùn)練后第4天，蟲草素給藥組的正確反應(yīng)率與模型組相比并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.144)。然而，有趣的是，在訓(xùn)練后第5天到第10天，蟲草素給藥組大鼠正確反應(yīng)率(86.36%±2.33%、85.91%±2.24%、92.73%±1.89%、94.09%±1.05%、95.00%±1.89%、97.27%±1.54%)明顯高于模型組(72.92%±2.84%、71.25%±4.17%、74.58%±3.11%、69.17%±3.39%、78.75%±4.73%、82.08%±4.04%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。除在訓(xùn)練后第4天和第6天外，其余訓(xùn)練時(shí)間內(nèi)蟲草素給藥組的正確反應(yīng)率與正常對(duì)照組比較并沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0.05)。

對(duì)各組動(dòng)物訓(xùn)練達(dá)標(biāo)天數(shù)與次數(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)與分析發(fā)現(xiàn)，模型組達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練天數(shù)(11.67±0.68)和總測試次數(shù)(233.3±13.7)明顯高于正常對(duì)照組(4.44±0.40、88.9±8.0)(P<0.01)(圖2)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)蟲草素給藥組大鼠達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需的訓(xùn)練天數(shù)和總訓(xùn)練次數(shù)(5.73±0.43、114.5±8.5)明顯低于模型組大鼠(P<0.01)(圖2)。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)，在訓(xùn)練3天后，與模型組相比，正常對(duì)照組動(dòng)物反應(yīng)時(shí)間(潛伏期)明顯較低(P<0.01)(圖3)。另外，給藥組在訓(xùn)練5天后，其反應(yīng)時(shí)間(潛伏期)較模型組也明顯降低(P<0.01)(圖3)。從動(dòng)物行為學(xué)訓(xùn)練結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)AD模型組大鼠的正確反應(yīng)率明顯低于正常對(duì)照組，達(dá)到學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)所需訓(xùn)練天數(shù)和訓(xùn)練總次數(shù)及反應(yīng)時(shí)間均明顯高于正常對(duì)照組及給藥組，表明在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的AD動(dòng)物模型是成功的。同時(shí)，我們的行為學(xué)結(jié)果也強(qiáng)烈提示，口服蟲草素可以預(yù)防Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷。

圖1 大鼠的正確反應(yīng)率 Fig.1 Correct response rate of rats

圖2 大鼠達(dá)標(biāo)所需的訓(xùn)練次數(shù)Fig.2 Trails of reaching standard of rats 注：與模型組比較，**P<0.01。Note:Compared with model group,**P<0.01.

圖3 蟲草素對(duì)大鼠短時(shí)記憶的影響Fig.3 Effects of cordycepin on short-term memory in rats

3.2 蟲草素抑制AD模型大鼠海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶的過度激活

如圖4所示，AD模型組大鼠海馬區(qū)AChE活性(52.49±5.20)顯著高于正常對(duì)照組(20.48±1.44)(P<0.001)。而與模型組相比，蟲草素給藥組大鼠海馬區(qū)AChE活性顯著降低(25.70±1.99)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。生化檢測結(jié)果表明蟲草素可以有效地抑制Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠海馬區(qū)AChE活性的升高。提示，蟲草素改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力可能與其抑制了模型大鼠海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶的過度激活有關(guān)。

圖4 蟲草素對(duì)海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶活性的影響Fig.4 Effect of cordycepin on the activity of AChE in hippocampus注：與模型組比較，***P<0.001。Note:Compared with model group, ***P<0.001.

3.3 蟲草素對(duì)海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

最后，我們對(duì)各組動(dòng)物海馬區(qū)進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，AD模型大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞帶排列紊亂、稀疏，出現(xiàn)神經(jīng)元丟失、可見核固縮或溶解、細(xì)胞空泡、胞體不規(guī)則等形態(tài)學(xué)改變(圖5A)。統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠CA1區(qū)椎體神經(jīng)元密度顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量雖然也有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，蟲草素給藥組大鼠神經(jīng)元數(shù)量顯著增多，細(xì)胞形態(tài)也較正常。與對(duì)照組大鼠相比，蟲草素組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量與形態(tài)并沒有顯著性差異(圖5B)。結(jié)果表明，蟲草素可以明顯對(duì)抗Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型大鼠CA1區(qū)神經(jīng)元的損傷。提示，蟲草素對(duì)腦組織結(jié)構(gòu)損傷所致的認(rèn)知功能障礙有預(yù)防作用。

圖5 蟲草素對(duì)AD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元數(shù)密度的影響Fig.5 Effects of cordycepin on the neurons density in hippocampus of AD rats注：A圖表示蟲草素對(duì)AD大鼠海馬錐體神經(jīng)元的影響，Bar=200 μm；B圖表示蟲草素對(duì)AD大鼠海馬神經(jīng)元丟失的影響。Note:A shows effects of cordycepin on hippocampal pyramidal neurons in AD rats,Bar=50 μm.;B shows effects of cordycepin on hippocampal neuronal loss in AD rats.

4 討論

可溶性Aβ寡聚物在腦內(nèi)的過度沉積可引起神經(jīng)毒性，引發(fā)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)[27,28]及突觸功能障礙[5]，使腦組織發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷，被認(rèn)為是導(dǎo)致AD病人神經(jīng)元損傷的主要病因。AD病人腦內(nèi)Aβ的沉積片段主要為Aβ1-42序列，有文獻(xiàn)表明，Aβ25-35片段保留了Aβ的大部分物理和生物特性，與內(nèi)源性Aβ1-40和Aβ1-42片段神經(jīng)毒性相似[6]。重要的是，Aβ25-35較完整的Aβ肽鏈聚集迅速，不需要超過7天的老化時(shí)間才會(huì)聚集為有毒物質(zhì)，且納摩爾濃度的Aβ25-35即可誘發(fā)神經(jīng)退行性病變[6]。D-半乳糖衰老模型已是國內(nèi)外研究公認(rèn)的衰老模型。D-半乳糖是一種氧化性物質(zhì)，在體內(nèi)被還原代謝為不可代謝產(chǎn)物半乳糖醇，大量堆積在細(xì)胞內(nèi)，會(huì)使細(xì)胞代謝紊亂，出現(xiàn)退行性變化，造成學(xué)習(xí)記憶能力障礙。D-半乳糖致衰老的主要機(jī)制是其可以提高體內(nèi)自由基水平，產(chǎn)生過氧化損傷，降低機(jī)體抗氧化能力，與正常老化相似[7]。另外，D-半乳糖可以使免疫器官老化，免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能下降。因此，本實(shí)驗(yàn)采用海馬區(qū)注射Aβ25-35誘發(fā)記憶障礙聯(lián)合腹腔注射D-半乳糖加速動(dòng)物衰老的方法建立復(fù)合型AD動(dòng)物模型，該模型具有AD病人的癡呆癥狀及接近AD病人體內(nèi)衰老病理環(huán)境，是一種比較理想且模擬程度較高的AD造模方法[10,11,20,21]。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)注射D-半乳糖后，大鼠背部毛色逐漸發(fā)黃，無光澤，不活躍。但在蟲草素給藥組，我們卻發(fā)現(xiàn)，在注射D-半乳糖第26天開始至給予蟲草素灌胃數(shù)天后上述大鼠衰老現(xiàn)象明顯得到改善，而模型組大鼠隨著造模時(shí)間的深入，其衰老現(xiàn)象則變得更加嚴(yán)重，脫毛且毛色暗沉，大便不成形，行動(dòng)遲緩。在Y型迷宮測試中，我們觀察到模型大鼠行動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍，許多在給予電擊后才緩慢走向下一個(gè)區(qū)域，且在靠近三角區(qū)域及三角區(qū)域猶豫停留時(shí)間較長。有些模型大鼠在走近三角區(qū)時(shí)開始扭頭觀望其余兩臂，而對(duì)照組和蟲草素給藥組大鼠并無這種現(xiàn)象，我們由此推測模型組大鼠其視力也有所下降。眾所周知，衰老與癡呆有著密不可分的關(guān)系，在本研究中，我們采用Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型很好的模擬了這一病理現(xiàn)象。有趣的是，在蟲草素治療組及空白對(duì)照組中，我們發(fā)現(xiàn)動(dòng)物明顯較活躍，有些在燈亮?xí)r直接跳躍至下一個(gè)區(qū)域，正確率及反應(yīng)時(shí)間均明顯優(yōu)于模型組(圖1)。表明蟲草素可明顯延緩Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型大鼠的衰老進(jìn)程，并成功地預(yù)防了AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

乙酰膽堿(ACh)是中樞膽堿能通路中維持高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)的一種重要神經(jīng)介質(zhì)，在記憶活動(dòng)中起著重要作用[22]。乙酰膽堿酯酶(AChE)是一種能夠水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的生物酶，AChE的過度激活會(huì)破壞海馬區(qū)ACh含量的穩(wěn)態(tài)，影響正常的突觸傳遞。AD患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在多種神經(jīng)遞質(zhì)異常。已有研究表明，存在淀粉樣蛋白斑塊的海馬體AChE 活性較高[19]，AChE的過度激活導(dǎo)致大腦乙酰膽堿的缺乏是AD患者記憶障礙的一個(gè)主要原因[19,23,24]。目前，通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿水解來增強(qiáng)膽堿能功能，改善認(rèn)知功能仍是公認(rèn)治療AD的一種有效治療方法[23,24]。本研究證明，蟲草素可明顯抑制乙酰膽堿酯酶過度活化的現(xiàn)象(圖2)，提示蟲草素可通過抑制海馬區(qū)域AChE過度活化，維持海馬區(qū)ACh的水解與合成處于動(dòng)態(tài)平衡，來改善膽堿能障礙，從而起到關(guān)鍵的神經(jīng)元保護(hù)作用(圖3)，并最終改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這一在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果與我們之前在原代培養(yǎng)的海馬細(xì)胞離體實(shí)驗(yàn)上的結(jié)果是一致的，再一次證明了蟲草素改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷作用與抑制乙酰膽堿酯酶過度活化密切相關(guān)。此外，正如前面所述，腹腔注射D-半乳糖加速動(dòng)物衰老的病理機(jī)制主要與其提高體內(nèi)自由基水平，產(chǎn)生過氧化損傷，降低機(jī)體抗氧化能力相關(guān)。而已有的大量研究(包括我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究)已經(jīng)表明，蟲草素可以有效清除自由基，降低缺血缺氧對(duì)腦組織的氧化損傷，并最終對(duì)神經(jīng)元起到保護(hù)作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們有理由推測蟲草素對(duì)Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)的AD模型動(dòng)物的損傷保護(hù)作用也有可能與其抗氧化作用機(jī)制相關(guān)，當(dāng)然，這一作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)蟲草素可明顯抑制Aβ25-35聯(lián)合D-半乳糖誘導(dǎo)老年癡呆動(dòng)物模型認(rèn)知障礙、行為障礙及衰老病理現(xiàn)象的發(fā)生。潛在的保護(hù)機(jī)制可能與其抑制AChE 過渡激活，增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，減少海馬區(qū)神經(jīng)元各種毒性損傷等有關(guān)。提示蟲草素在臨床治療阿爾茨海默癥等相關(guān)認(rèn)知障礙的退行性疾病中具有良好的藥用開發(fā)前景。