電針對脊髓損傷大鼠P2X4、IL-1β表達的影響

冀麗麗 李奕琴 付海城 倪廣寶 周建瑞

摘要：目的觀察電針對脊髓損傷大鼠模型痛行為及脊髓水平小膠質細胞（P2X4）和白介素-1β（IL-1β）表達的影響，為針刺防治脊髓損傷后中樞性疼痛的臨床治療提供依據。方法雄性SD大鼠40只，隨機分為正常組、模型組、假手術組、電針組，每組10只。建立脊髓損傷大鼠模型，電針組取雙側腰1“夾脊穴”、“委中”，每天1次，每次20min，共治療7 d。測定大鼠熱刺激爪退縮閾值、機械縮爪閾值，用RT-PCR技術檢測大鼠脊髓P2X4mRNA及IL-1βmRNA的表達變化。結果脊髓損傷大鼠痛閾上升，脊髓水平P2X4mRNA及IL-1βmRNA表達增加。與模型組相比，電針組可以改善熱痛閾、刺痛閾（P<0.05），抑制脊髓P2X4及IL-1β表達（P<0.05）。結論電針能抑制脊髓小膠質細胞活化及炎性因子的分泌從而發揮鎮痛效應。

關鍵詞：電針;脊髓損傷;中樞性疼痛;P2X4;白介素-1β（IL-1β）

【中圖分類號】R?? 【文獻標識碼】A??? 【文章編號】1673-9026（2020）04-036-03

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）對上、下行神經通路的神經創傷會導致感覺和運動控制受損[1]，患者常并發中樞性疼痛[2]，屬于病理性疼痛，表現為劇烈的、陣發性的、難以忍受的疼痛，給患者帶來極大地痛苦，嚴重影響生活質量。P2X4是脊髓小膠質細胞表面受體之一，在脊髓損傷后P2X4受體表達的迅速上調。炎癥因子白介素1β[3]（ Interleukin-1β，IL-1β） 在神經病理性疼痛的發生和發展中起著關鍵作用。本實驗旨在研究電針對脊髓損傷后中樞性疼痛大鼠機械痛閾和熱痛閾以及脊髓水平P2X4和IL-1β表達的影響，為針灸治療脊髓損傷后出現的中樞性疼痛臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物

健康Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，雄性，3月齡，體重（300±20）g，SPF級。購于湖北醫藥學院動物實驗中心。大鼠適應性飼養5天后進行實驗。飼養室及行為學實驗室溫度為23-25 ℃，濕度50±10%，每日早晨8：00至20：00開燈，20：00至次日8：00熄燈。

1.2 造模方法

采用公認的WADE法制造脊髓損傷后中樞性疼痛模型，用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射，麻醉大鼠，將大鼠置于俯臥位，在背部正線L1脊髓節段處沿上下各1.5cm逐層切開皮膚，在胸12-腰3之間將雙側椎旁肌肉鈍性分離，咬除胸13-腰2棘突，暴露腰1節段脊髓，應用脊髓損傷儀將重20g、尖端直徑2mm的銅棍從15cm處墜落至脊髓，造成脊髓損傷，假手術組不造成脊髓損傷。手術傷口局部使用少許青霉素粉消炎抗菌，逐層縫合傷口。術后蘇醒后，放回籠中觀察。術后3天每日用碘伏擦拭傷口1次消炎抗菌。對SCI大鼠，人工擠壓排尿每日3次，3日后改為每日2次，直至自主排尿。

1.3 動物分組及處理

利用隨機數字表法將40只大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、假手術組、電針組，每組10只。

①正常組（Normal group）：正常飼養7天。

② 模型組（Model group）：建立脊髓損傷大鼠模型，造模后正常飼養7天。

③假手術組（Sham group）：所有手術步驟同模型組，暴露腰1脊髓節段后不損傷脊髓，造模后正常飼養7天。

④電針組（Electro-acupuncture group，EA group）：模型建立后，每天電針雙側腰1“夾脊穴”、“委中”，每次20min，連續治療7天。

正常組、模型組和假手術組在治療期間，每天抓取一次，不做其他特殊處理。所有大鼠存活期滿7天后，麻醉處死。

1.4 腧穴的選擇及電針操作

選取雙側腰1“夾脊穴”（Ex-B2）、“委中”（BL 40），按照《實驗針灸學》[4]所附的常用實驗動物針灸穴位取穴。

“腰1夾脊穴”深度5㎜，“委中”深度3㎜。將同側腰1“夾脊穴”和“委中””穴相連，連接韓式穴位神經刺激儀（6805-D型，汕頭市醫用設備廠有限公司生產），頻率2/100 Hz，強度1～3mA（以動物肢體微顫為度），持續20 min，每天1次，連續治療7 d。

1.5 指標檢測

1.5.1? 行為學觀察

各組均在上午9：00～11：00進行行為學檢測，各組行為學檢測均在上午9：00～11：00進行，且由不了解實驗目的、意義和實驗分組情況的固定人員進行。每日對大鼠自發痛行為學的變化（舔咬、搔抓損傷水平以下部位如后部軀干、后足、尾部等）觀察2次。

1.5.2? 熱刺激爪退縮閾值（Thermal withdrawal latency， TWL）

測量大鼠熱刺激爪退縮閾值的方法，在大鼠清醒狀態下，采用熱刺痛儀，測定術前1 天，術后3、5、7天的TWL。由以下公式計算：TWL變化百分率：TWL改變百分率（%）=（即刻痛閾-基礎通閾）/基礎痛閾×100。

1.5.3? 機械縮爪閾值（Mechanical withdrawal threshold， MWT）

在大鼠清醒狀態下，采用爪觸痛儀測定術前1天，術后3、5、7天的機械縮爪閾值。由以下公式計算：MWT變化百分率：MWT改變百分率（%）=（即刻痛閾-基礎通閾）/基礎痛閾×100。

1.5.4? 逆轉錄聚合酶鏈反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測P2X4和IL-1β的含量

Trizol法抽提組織總mRNA，逆轉錄、實時熒光定量PCR反應根據試劑盒說明書操作。引物序列分別為：P2X4上游引物：5`-AACATCCTCCCCAACATC-3`，下游引物：5`-CTCAACTGCCAT CTCCTG -3`，IL-1β： 上游引物 5`-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3`， 下游引物5`-TGCTGAT GTACCAGTTGGGG-3`;β-actin： 上游引物5`-TCATGAAGTGTGACGTTGACATCCGTAAAG-3`， 下游引5`-CGTAGAAGCATTTGCGGTGCA CGATGGAGG-3`。PCR反應條件為：94℃預變性5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s，32次反復循環擴增，最后72℃延伸10min。以β-actin為內參照，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，用凝膠成像分析系統，對PT-PCR產物電泳條帶進行吸光度（A）值分析。

1.6統計方法

實驗數據應用Spss 20.0統計學軟件進行分析，所有實驗數據均用平均值±標準差（）表示。各組熱刺激爪退縮閾值在不同時間點的比較采用雙因素方差分析（two-way ANOVA），組間比較采用Turkey法。RT-PCR檢測中P2X4和IL-1β的含量則采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統計，組間比較采用LSD法。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 行為學測定

實驗期間，各組大鼠正常，在活動時未表現出任何的運動障礙，在站立休息時也未表現出喜歡用某一側肢體來承重的現象，沒有出現大小便失禁的現象，沒有煩躁、撕咬肢體、頻繁的搖動尾巴、食欲降低等表現。

2.2 熱刺激爪縮退閾值變化率

與正常組比較，假手術組各時間點TWL差異沒有統計學意義（P>0.05），模型組術后3、5、7 d其TWL均降低，有顯著差異（P<0.05），模型組TWL持續降低至術后7 d。與模型組相比，假手術組術后3、5、7 d的TWL均有顯著差異（P<0.05）。術后3 d電針組TWL與正常組比較有顯著差異（P<0.05），術后5、7 d與模型組比，電針治療組TWL升高，有顯著差異（P<0.05）。

2.3機械縮爪閾值（ mechanical withdrawal threshold， MWT）變化率

與正常組比較，模型組術后3、5、7天MWT下降，有顯著差異（P<0.05），假手術組沒有顯著差異（P>0.05）。與模型組比較，假手術組術后3、5、7天的MWT有顯著差異（P<0.05），電針組術后3 天 MWT與正常組比較有顯著差異（P<0.05），術后5、7天與模型組比MWT上升，有顯著差異（P<0.05）。

2.4脊髓水平P2X4 mRNA表達變化

與正常組相比，模型組P2X4 mRNA表達明顯上升（P<0.05）。假手術組中的P2X4 mRNA表達與正常組之間未見統計學差異（P>0.05）。假手術組與模型組之間有顯著差異（P<0.05）。電針組與模型組比較，P2X4 mRNA表達下降，其差異有統計學意義（P<0.05）。

2.5脊髓水平IL-1β mRNA表達變化

與正常組相比，模型組IL-1β mRNA表達明顯上升（P<0.05）。假手術組與正常組之間之間的差異沒有統計學意義（P>0.05）。假手術組與模型組之間有顯著差異（P<0.05）。電針組與模型組比較，IL-1βmRNA表達明顯下降（P<0.05）。結果見表4。

3討論

與臨床其他治療方法相比，針刺治療神經病理性疼痛療效顯著、安全性高、生理干擾小、副作用小，具有其顯著的優越性。針刺效應主要是通過刺激腧穴來調整臟腑、調節氣血和疏通經脈，從而發揮針刺鎮痛作用。夾脊穴電針能抑制前炎性細胞因子的表達，減輕過度的炎癥反應對脊髓組織造成的繼發性損傷[5]。

小膠質細胞是中樞神經系統的“巨噬細胞”[6]。正常情況下，小膠質細胞處于靜息狀態，表面有少量受體的表達，主要包括趨化因子受體、P2X受體（P2X receptors，P2XRS）和Toll樣受體（toll like receptors，TLRS）。脊髓損傷后受體表達上調，作用于其下游信號，促進脊髓小膠質細胞的激活。而活化的小膠質細胞表面表達的 P2X4受體可以誘導神經病理性疼痛[7]。同時活化的小膠質細胞可釋放大量的細胞因子、炎癥介質和神經活性物質，如白介素-1β（IL-1β）[8]、腫瘤壞死因子（TNF-α）、一氧化氮（NO）等，上述物質又能作用于未活化的脊髓小膠質細胞擴大疼痛反應[9]，引起神經炎性反應和神經免疫反應，這可能就是神經損傷產生和維持疼痛的原因[10]。

本研究結果提示電針治療可以調節熱痛閾和刺痛閾，發揮鎮痛作用。RT-PCR結果中，脊髓損傷后大鼠脊髓P2X4mRNA及IL-1βmRNA表達明顯上升，提示P2X4及IL-1β參與神經病理性疼痛發生過程。針刺治療后脊髓中P2X4mRNA及IL-1βmRNA表達有明顯下降。

綜上所述，我們推測針刺通過抑制脊髓小膠質細胞的激活，減少活化小膠質細胞釋放的IL-1β等炎性因子，從而減輕脊髓損傷后出現的痛覺過敏。但由于本研究實驗樣本量小，觀察時間點較少，實驗結果還有待進一步證實。而且本研究只觀察了電針對 P2X4和 IL-1β 的影響，其它細胞因子可能也參與了電針緩解脊髓損傷后中樞性疼痛機制。今后如能再進行大樣本、多時間點、多細胞因子的重復性實驗，可進一步深入探討電針治療神經病理性疼痛的作用機制。

參考文獻：

[1]Fassett HJ，et al.Alterations in motor cortical representation of muscles following incomplete spinal cord injury in humans[J].Brain Sci，2018;8（12）：205-212.

[2]Widerstrom-noga E，Neuropathic pain and spinal cord injury： pheno -types and pharmaco -logical management [J].Drugs，2017;77（ 9）：967-984.

[3]Li X，Shen J，Zhong Z，et al.Paeoniflorin： a monomer from traditional Chinese medical herb ameliorates Schistosoma japonicum egginduced hepatic fibrosis in mice [J]. J Para-sitol，2009，95（ 6） ： 1520-1524.

[4]張露芬.實驗針灸學[M].北京：化學工業出版社，2010：219-224.

[5]王賽，鄒恩苗，林海燕，等.夾脊、督脈電針對大鼠脊髓損傷前炎性細胞因子表達的影響[J].中國康復醫學雜志，2013，28（5）：389-392.

[6]周曉艷，徐營營，謝兆宏，等.炎癥反應與神經系統變性疾病的研究進展[J].中國老年學雜志，2012，32（1）：196-199.

[7] Tsuda M， Shigemoto-Mogami Y ， Koizumi S， et al. P2X4 receptors induced in spinal microglia gate tactile allodynia? after? nerve? injury [J] .? Nature，2003，424（6950）：778-83.

[8]Tiwari V，Yun G，Raja? S N. Modulating the delicate glial-neuronal interactions in neuropathic pain： Promises and potential caveats [J].Neurosci Biobehav Rev，2014，45：19-27.

[9]肖凡，朱彪，廖慶武，等.慢性疼痛中脊髓小膠質細胞激活機制的研究進展[J].復旦學報，2012， 39（3）：324-330.

[10]TSUDA M， INOUE K， SALTER MW. Neuropathic pain and spinal microglia： a big problem from molecules in "small" glia[J].Trends Neurosci， 2005， 28（2）：101-107.

基金項目：十堰市引導性項目（17Y09）

作者簡介：冀麗麗，女，1990.02.02，湖北省十堰市，漢，碩士研究生，住院醫師，神經康復