HPLC法定量測定青橄欖中沒食子酸含量

馮 娟，李秋平，黃思睿，張清杰，覃 亮

(1 廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520；2 肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東 肇慶 526061；3茂名市食品藥品檢驗所，廣東 茂名 525000；4 廣州正一實驗裝備有限公司，廣東 廣州 510095)

青橄欖，別稱黃欖、青果、山欖，為干燥成熟果實[1]。主要有檀香、自來圓、長城、惠圓、普通級等品種，以藥用檀香種最好，藥用保健價值高，其對治療慢性咽炎，聲音嘶啞，喉嚨干腫及異物感，扁桃體炎，咳嗽等癥狀，有較好的效果[2-3]。青橄欖收載于《中藥志》，現代藥理研究表明，青橄欖在抗菌[4-5]、保肝[6-7]、抗腫瘤[8]等均表現出較好的活性。通過文獻發現，目前尚未有人對青橄欖中沒食子酸的含量進行分析報道。本試驗中采用高效液相色譜法對青橄欖的成分沒食子酸的含量進行了研究，旨在建立專屬性較強的含量測定方法。

1 儀器與試劑

1.1 實驗儀器

LC-2012CHT高效液相色譜儀，日本島津；UV-2450紫外可見分光光度計，常州澳華儀器有限公司；MS205DU電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 試 劑

沒食子酸對照品，購于中國食品藥品檢定研究院；青橄欖購于大參林連鎖醫藥公司；甲醇，默克股份，色譜純；其他試劑均為分析純，所用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱定沒食子酸對照品15.92 mg，至50 mL的容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖均勻，然后精量1 mL溶液于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得(每一毫升中含0.0127 mg沒食子酸對照品)。

2.2 供試品溶液的制備

將青橄欖用粉碎機打粉，取青橄欖細粉約7.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 4 mol/L HCl溶液，稱定其重量，加熱回流4 h，放冷后，用4 mol/L HCl溶液補足減失的重量，搖勻，精密量取續濾液2 mL于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液[9-10]定容至刻度。精量2 mL溶液到5 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，用0.45 μm的有機微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

選用Inertsil ODS-3(5 μm)色譜柱，以0.1%磷酸溶液-甲醇(91:9)做流動相，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，測定波長219 nm，進樣量10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性的考察

吸取青橄欖供試品溶液、沒食子酸對照品溶液各10 μL，分別注入色譜儀，在色譜條件下測定，經驗證，樣品溶液色譜圖中未見其他組分和輔料對測定組分沒食子酸的干擾。

圖1 沒食子酸色譜圖

2.4.2 線性關系的考察

精密稱量沒食子酸對照品0.01529 g至50 mL的容量瓶中，加50%甲醇溶液溶解，并用其定容至刻度，搖均勻，分別精量1、2、3 mL至25 mL容量瓶中；1、3、5 mL至50 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液定容至刻度，搖均勻，即得6個濃度(0.006368 mg/mL、0.012736 mg/mL、0.019104 mg/mL、0.025472 mg/mL、0.031840 mg/mL、0.038208 mg/mL)的對照品溶液，各進樣10 μL，注入色譜儀中，按本實驗擬訂的色譜條件測定。以沒食子酸對照品測得的峰面積值(Y)為縱坐標，對照品的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得出回歸方程：y=77820235x+6255，r=0.9999884(n=6)。結果表明，沒食子酸的進樣量在0.03194～1.14624 mg范圍內與峰面積呈良好的線性關系，符合外標法定量測定的要求。

2.4.3 精密度實驗

取同一濃度(0.012736 mg/mL)的對照品溶液，在本實驗擬定的色譜條件下連續進樣6次，測沒食子酸的峰面積。實驗結果RSD%為0.27%(n=6)，顯示有良好精密度(結果見表1)。

表1 精密度試驗

2.4.4 穩定性實驗

取同一批供試品溶液，制備后，按含量測定方法吸取10 μL待測溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h注入色譜儀一次，測定其峰面積值，共測試6次[11]。結果含量的RSD%為0.2%(n=6)，表明在12個小時內供試品溶液中沒食子酸的含量能基本維持穩定(見表2)。

表2 穩定性實驗

2.4.5 重復性試驗

取同一個批號的6份供試品[12]，在相同的色譜條件下進行測定，結果表明沒食子酸的平均含量是3.336 mg/g，RSD%為0.27%，其相對標準偏差較小，不超過規定范圍RSD%=3%，說明明重復性良好(見表3)。

表3 穩定性實驗

2.4.6 加樣回收實驗

為了驗證所建立的方法對供試品含量測定是否有影響，對相同濃度的同一批供試品進行6次的回收率實驗。結果表明，測得沒食子酸的平均回收率為99%，RSD%=0.38%，所測得結果不超過規定的平均回收率85%～120%范圍，表明該方法可行(見表4)。

2.4.7 樣品含量測定

取三批不同產地的青橄欖制備的供試品溶液，按設定的色譜條件，進樣10 μL，測定峰面積，計算含量。結果說明該法穩定性較高(見表5)。

表5 樣品含量測定

3 結 論

經過實驗，確立了青橄欖中沒食子酸的含量測定的方法。本實驗方法采用Inertsil ODS-3(5 μm)為色譜柱，0.1%磷酸-甲醇(91:9)為流動相，檢測波長為219 nm測定青橄欖中沒食子酸的含量，重現性、穩定性、精密度好，可應用于青橄欖中沒食子酸含量的測定。