枇杷葉總黃酮的減壓內部沸騰提取工藝研究*

翁艷英，張貞發

(廣西民族師范學院化學與生物工程學院，廣西 崇左 532200)

枇杷葉，別名巴葉、蘆桔葉，分布廣泛，作為傳統中藥，具有清肺、止咳、抗炎等功效[1]。研究表明枇杷葉提取物具有抗感染、抗病毒、降血糖等藥理作用[2]，而其含有的豐富黃酮類化合物[3]具有明顯的抗氧化作用[4-5]，并對小鼠急性肝損傷具有保護作用[6]。

目前，對枇杷葉總黃酮的提取工藝研究已有報道，如回流提取[7-8]，提取時間較長；超聲提取[9]，提取30 min，枇杷葉總黃酮得率為7.23%；纖維素酶輔助提取[10]，提取80 min，正交實驗中枇杷葉總黃酮含量最高值為11.32 mg/g。近年來，減壓內部沸騰法已成功應用到多種天然產物總黃酮[11-12]的提取中，該法既能保證活性成分提取率，又具有提取時間短，提取溫度低，易操作的顯著特點。由此，本實驗以枇杷葉為原料，通過減壓內部沸騰法提取總黃酮，考察提取劑濃度、提取劑用量、提取溫度及提取時間等因素的影響，并在單因素實驗基礎上正交優化提取工藝，為枇杷資源的綜合開發提供參考。

1 材料與試劑

1.1 材 料

枇杷葉，購于崇左市藥材市場，烘干、粉碎備用。

1.2 試 劑

蕓香葉苷對照品(AR)；無水乙醇(AR)；硝酸鋁(AR)；亞硝酸鈉(AR)；氫氧化鈉(AR)。

1.3 儀 器

722型可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；循環水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司；超級恒溫水浴鍋，南京大學應用物理研究所；電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司。

1.4 方 法

1.4.1 減壓內部沸騰提取枇杷葉總黃酮

準確稱取0.50 g枇杷葉粉末，采用60%乙醇解吸20 min，然后按照圖1進行總黃酮的減壓內部沸騰提取兩次，合并濾液，獲得總黃酮提取液，備用。

圖1 枇杷葉總黃酮的提取流程圖

1.4.2 枇杷葉總黃酮的含量測定

(1)總黃酮的含量測定

參照文獻[13]對枇杷葉的總黃酮進行含量測定。取1.20 mL枇杷葉總黃酮提取液于25.00 mL比色管，加入30%的乙醇溶液至12.50 mL，搖勻，加入0.70 mL質量分數為5%的亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置5 min，然后加入0.70 mL質量分數為10%的硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，接著加入5.00 mL質量分數為4%的氫氧化鈉溶液，搖勻，30%的乙醇溶液定容。采用試劑空白做參比，在510 nm的波長處測定吸光度A，再根據標準方程計算總黃酮的含量。

(2)標準曲線的制作

精確稱取蕓香葉苷0.0225 g，30%乙醇溶解，定容至100 mL。分別量取0.00 mL，1.20 mL，2.40 mL，4.80 mL，7.20 mL，9.60 mL質量濃度為0.255 g/L的蕓香葉苷標準溶液于25.00 mL比色管，按照總黃酮含量測定步驟進行顯色分析，于510 nm波長下測定吸光度。以吸光度和蕓香葉苷濃度繪制標準曲線，蕓香葉苷濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到線性回歸方程為A=8.7627C+0.00516，其中A為吸光度，C為蕓香葉苷濃度(g/L)，相關系數R2=0.9998，見圖2。

圖2 標準曲線

(3)總黃酮提取率計算公式

根據標準曲線及提取率公式計算枇杷葉總黃酮的提取率，公式見式(1)。

(1)

1.4.3 單因素實驗

稱取0.50 g枇杷葉粉末，60%乙醇進行解吸20 min，以乙醇溶液作為提取劑，0.055 MPa壓力下進行單因素實驗。

固定15 mL提取劑，提取溫度 60 ℃，提取時間4 min的條件，改變提取劑乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)，考察提取劑乙醇濃度對枇杷葉總黃酮提取率的影響。

固定15 mL提取劑，提取溫度 60 ℃，提取劑濃度70%的條件，改變提取時間(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)，考察提取時間對枇杷葉總黃酮提取率的影響。

固定15 mL提取劑，提取時間6 min，提取劑濃度70%的條件，改變提取溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)，考察提取溫度對枇杷葉總黃酮提取率的影響。

固定提取劑濃度70%，提取時間6 min，提取溫度70 ℃的條件，改變提取劑乙醇用量(20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL)，考察提取劑乙醇用量對枇杷葉總黃酮提取率的影響。

1.4.4 正交實驗

在單因素實驗基礎上進行四因素三水平的正交實驗，研究提取劑乙醇濃度、提取時間、提取溫度及提取劑用量四個因素對枇杷葉總黃酮提取率的影響。正交實驗因素水平見表1。

表1 正交實驗因子水平

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 提取時間對總黃酮提取率的影響

提取時間對枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著提取時間的延長，枇杷葉中總黃酮提取率也增大，當提取時間為6 min時提取率最大，隨后枇杷葉總黃酮的提取率反而下降。因此選擇4 min、6 min、8 min三水平進行正交實驗。

圖3 提取時間對總黃酮提取率的影響

2.1.2 提取劑濃度對總黃酮提取率的影響

提取劑濃度對枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖4所示。從圖4可以看出，提取劑濃度小于70%時，枇杷葉中總黃酮的提取率快速增長，繼續提高提取劑濃度，總黃酮提取率呈下降趨勢。因此選擇60%、70%、80%三水平進行正交實驗。

圖4 提取劑濃度對總黃酮提取率的影響

2.1.3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

提取溫度對枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖5所示。由圖5可知，低溫不利于枇杷葉物料內部沸騰，提取率不高；隨著溫度的升高，溶劑分子運動激烈，70 ℃時提取率最高，主要是55 kPa的提取壓力條件下，70%乙醇沸點為70 ℃左右[14]，此時枇杷葉物料內部得到充分沸騰，強化了傳質過程，使提取效果達到最佳。再持續升溫，可能造成雜質溶出率增大及黃酮結構被破壞[15]，使枇杷葉總黃酮提取率減小。因此選擇60 ℃、70 ℃、80 ℃三水平進行正交實驗。

圖5 提取溫度對總黃酮提取率的影響

2.1.4 提取劑用量對總黃酮提取率的影響

提取劑用量對枇杷葉總黃酮提取率的影響如圖6所示。從圖6可知，對0.50 g物料，隨著提取劑用量的增加，枇杷葉總黃酮提取率也增大，當提取劑乙醇用量在30 mL時總黃酮的提取率最高。繼續增加提取劑用量大于30 mL時，提取率下降并趨于平穩，這與提取劑用量大使其擴散速率大，增加了雜質的溶出率有關。因此選擇25 mL、30 mL和35 mL三水平進行正交實驗。

圖6 提取劑用量對總黃酮提取率的影響

2.2 正交實驗結果分析

按表1的正交因子水平設計的正交實驗結果見表2。表2的實驗結果反映了減壓內部沸騰提取枇杷葉總黃酮的最佳組合為A2B2C2D2，即70%乙醇作為提取劑且提取劑乙醇用量為30 mL，在70 ℃條件下減壓提取6 min。對正交實驗最佳組合進行三組驗證實驗，分別稱取0.50 g的枇杷葉粉末3份，60%乙醇解吸20 min，加入30 mL 70%乙醇，在70 ℃、0.055 MPa條件下提取6 min，提取兩次。結果顯示，枇杷葉總黃酮提取率平均值達到9.48%。實驗結果充分驗證了正交實驗優化得到的最佳提取工藝的合理性。

表2 正交實驗結果

3 結 論

通過減壓內部沸騰法提取枇杷葉總黃酮，在單因素實驗基礎上進行正交實驗優化提取工藝。實驗結果表明，提取枇杷葉總黃酮的最佳工藝參數為：0.50 g的枇杷葉粉末，60%乙醇解吸20 min，提取劑濃度為70%，提取劑用量為30 mL，在70 ℃和0.055 MPa條件下提取2次，每次6 min，此條件下總黃酮提取率為9.48%。減壓內部沸騰提取工藝具有提取時間短，提取溫度低，提取裝置簡單、成本低，易操作等特點，這將為枇杷葉總黃酮的活性研究提供理論數據，并為枇杷資源的開發提供科學依據。