薯蕷皂苷抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化對老年大鼠急性腦出血模型血灶周圍細胞凋亡和炎性因子的影響

田青， 黃齊飛， 黃天韜， 周倩， 翟中良

（1.鄂東醫療集團市中心醫院，湖北理工學院附屬醫院老年病科，湖北黃石 435000；2.鄂東醫療集團市中心醫院，湖北理工學院附屬醫院檢驗科，湖北黃石 435000）

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是指非外傷性腦實質內血管破裂引起的出血，以中老年人多發，每年全球新發200萬腦卒中的患者，腦出血占到10% ～15%[1]。急性腦出血（acute cerebral hemorrhage，ACH）是指腦出血的急性期，是腦實質內出血的危急重癥，起病急，進展迅速。目前，腦出血的機制尚不完全清楚，且缺乏有效的治療手段[2]。但腦水腫、細胞凋亡、炎癥反應等過程在腦出血的病理生理中具有重要作用，如何有效地降低腦出血后的腦水腫和抑制腦出血后的炎性反應，是研究的熱點[3-4]。薯蕷皂苷（dioscin）廣泛存在于薯蕷科、百合科等藥用植物中，具有抗腫瘤[5]、抗炎[6]、抗骨質疏松[7]等生物學活性。已有研究表明，薯蕷皂苷可通過降低膠質細胞活化及維持超氧化物歧化酶（SOD）水平減輕腦卒中小鼠的神經損傷[8]，薯蕷皂苷元對大鼠腦短暫性局灶性腦缺血再灌注損傷具有明顯的抑制作用[9]，但薯蕷皂苷作用于腦出血的研究鮮有報道。因此，本研究探討薯蕷皂苷對老年大鼠急性腦出血模型血灶周圍細胞凋亡及炎性因子的影響，并分析其作用機制，以期為薯蕷皂苷的臨床應用開發提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物SPF級24 ～26個月齡雄性SD大鼠50只，購自湖北省實驗動物研究中心，動物質量合格證號：SCXK（鄂）2015-0018。飼養于湖北省實驗動物研究中心動物飼養室，標準飼料喂養，自由進水，光周期12/12 h，相對濕度為55%，溫度為22 ℃。

1.2藥物、試劑與儀器薯蕷皂苷（純度≥98%，廣州左克生物科技公司，批號：ZK-17102215）；水合氯醛、骨蠟（廣州齊云科技公司）；cleaved Caspase- 3、 Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9、Caspase- 9、 Bax、 Bcl- 2、 高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、Toll 樣受體4（TLR4）、核因子kappa B（NF- κB）p65、 磷 酸 化NF- κB p65（p- NF- κB p65）、GAPDH 等一抗，二抗（英國Abcam 公司）；原位末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）標記（TUNEL）檢測試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、細胞間黏附分子1（ICAM-1）免疫組織化學檢測試劑盒（上海碧云天生物科技公司）；白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-1β、IL-10 酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海康朗生物科技公司）。立體定位儀（美國Bio-sciences 公司）；手持牙科鉆（上海精密科學儀器公司）；光學、熒光顯微鏡（日本奧林巴期公司）；多功能酶標儀（瑞士TECAN 公司）。

1.3分組、造模與給藥將SD 雄性老年大鼠隨機分為5 組，即正常對照組， 模型對照組，薯蕷皂苷低、中、高劑量組，每組各10 只。除正常對照組外，其余各組大鼠構建急性腦出血模型，方法[10]：大鼠適應性喂養1周，使用微量注射器抽自體尾動脈血50 μL 備用（作為注入所用的血液）。35 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，后將大鼠置于立體定位儀。大鼠頭部行正中切口，以前囟為0 點，前囟后4 mm，中線左側3 mm處用手持式牙科鉆，鉆直徑為1 mm的孔，通過鉆孔以20 μL/min速度將血液緩緩推進腦組織，留針30 min 后拔出，用骨蠟封閉后縫合。正常對照組不注入血液。在大鼠腦組織注射自體鼠尾動脈血液后，可見大鼠迅速出現行為和神經功能異常，表現出反應遲鈍、皮毛無光澤、精神萎縮、進食下降，對側肢體出現癱瘓，行走追尾，嚴重者不能站立/打滾，個別大鼠呈現意識障礙、昏迷等表現，其功能異常程度與出血的嚴重程度相關。腦組織標本可見明顯的血腫占位。結合大鼠造模3 d后的行為學評分，計2 ～3 分者提示模型建立成功[11]。造模成功后，薯蕷皂苷低、中、高劑量組分別對應灌胃薯蕷皂苷20、40、80 mg·kg-1·d-1[12]，共給藥14 d。給藥期間，正常對照組和模型對照組灌胃等量溶媒（體積分數5%乙醇+ 蒸餾水）。給藥結束后，用100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，取血，斷頭取腦，分離腦組織血腫部位，冷凍備用。

1.4觀察指標與方法

1.4.1 腦組織含水量與腦指數計算及神經功能評分 各組大鼠處死后，迅速取出大腦，快速稱取大腦濕質量，然后將大腦放在95 ℃的烘箱中烘烤24 h，快速稱取大腦干質量，計算腦組織含水量與腦指數。腦組織含水量=（大腦濕質量- 大腦干質量）/大腦濕質量× 100%。腦指數= 濕腦質量/體質量× 100%。神經功能評分采用單盲法（評分者不知道實驗動物分組情況）。采用Longa[13]的5 分評分標準：0 分為無癥狀；1 分為不能完全伸展對側前爪；2 分為向對側轉圈；3 分為向對側傾倒；4 分為不能自行行走，意識喪失。1 ～3 分提示造模成功，0、4分提示造模不成功。

1.4.2 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察腦組織病理形態 將大鼠的腦組織樣本用體積分數10%甲醛固定、脫水、包埋，用石蠟切片機對包埋后的腦組織標本進行切片，然后對切片進行脫蠟和HE染色，應用光學顯微鏡觀察腦組織病理形態。

1.4.3 TUNEL染色法觀察腦組織細胞凋亡情況 取腦內血腫部位， 制成常規的石蠟切片， 按照TUNEL 檢測試劑盒說明書進行操作。方法：切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。體積分數0.3%H2O2封閉30 min。20 μg/mL 蛋白酶k 消化25 min。TdT 酶反應液，37 ℃孵育60 min。加入抗熒光素抗體，37 ℃孵育30 min，潮濕保溫。磷酸鹽緩沖液（PBS）振洗3 次。DAB 顯色10 min，蘇木精復染，脫水，封片。應用倒置顯微鏡，400倍視野下隨機選取5個視野，計算凋亡陽性細胞數百分比。

1.4.4 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測Caspase-3、cleaved caspase-3、Caspase-9、cleaved caspase-9、Bax、 Bcl- 2、 HMGB1、 TLR4、 NF- κB p65、p-NF-κB p65表達 取腦內血腫組織，剪碎后，加入細胞裂解液RIPA，以12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清。應用BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度。以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。用50.0 g/L 脫脂牛奶室溫封閉蛋白1 h， 加入一抗（分別為cleaved Caspase- 3、Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9、Caspase-9、Bax、Bcl-2、HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH等抗體，稀釋濃度為1∶1 000），于4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶HRP 標記的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h。電化學發光（ECL）顯示條帶、所得條帶用ImageJ軟件進行半定量分析。

1.4.5 ELISA 法檢測血清IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10的含量 收集各組大鼠血清，按照試劑盒說明書操作。方法：樣品加入反應孔，孵育45 min。洗滌液洗滌3 次。加入生物素標記的抗體，反應30 min。再次洗滌后，加入鏈霉親和素-HRP 抗體，反應30 min。加入顯色劑避光顯色15 min。最后加入終止液，應用酶標儀于波長450 nm 處測吸光度值。

1.4.6 免疫組織化學法檢測腦組織ICAM-1 表達 按照試劑盒說明書進行操作。方法：腦組織切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。使用枸櫞酸鈉緩沖液進行熱抗原修復。加入一抗ICAM-1（1∶200），4 ℃過夜，PBS 洗滌3 次。加入生物素標記二抗，37 ℃孵育1 h。DAB 顯色液反應染色。蘇木素染核，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于倒置顯微鏡40倍視野下觀察，實驗結果采用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統計算平均光密度值。

1.5統計方法采用SPSS 21.0 統計軟件進行數據分析，實驗數據以均數± 標準差（±s）表示。數據均符合正態分布，多組比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠腦含水量、神經功能評分及腦指數比較表1結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組的腦含水量明顯增多，神經功能評分及腦指數增高（P＜0.05）；與模型對照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組的腦含水量明顯減少，神經功能評分及腦指數明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠腦含水量、神經功能評分及腦指數比較Table 1 Comparison of the brain water content，nerve function score and brain index of rats in various groups （ ± s）

表1 各組大鼠腦含水量、神經功能評分及腦指數比較Table 1 Comparison of the brain water content，nerve function score and brain index of rats in various groups （ ± s）

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與模型對照組比較

組別正常對照組模型對照組薯蕷皂苷低劑量組薯蕷皂苷中劑量組薯蕷皂苷高劑量組N/只10 10 10 10 10腦含水量（p/%）73.21 ± 9.96 89.16 ± 12.32①88.69 ± 10.63 80.31 ± 7.97②75.99 ± 12.83②神經功能評分（s/分）0.05 ± 0.01 2.82 ± 0.26①2.69 ± 0.33 1.67 ± 0.41②1.03 ± 0.28②腦指數0.36 ± 0.06 0.72 ± 0.08①0.71 ± 0.07 0.48 ± 0.05②0.32 ± 0.06②

2.2各組大鼠腦組織病理變化比較圖1 結果顯示：正常對照組大鼠的腦組織結構正常，神經細胞形態正常，排列整齊，細胞著色均勻；模型對照組的腦組織結構出現異常，神經細胞之間的間隙增大并且排列紊亂，部分神經細胞出現胞質凝集、核固縮的現象；薯蕷皂苷低、中劑量組形態結構異常程度較模型對照組輕，但仍有部分細胞出現胞質凝集、核固縮現象，薯蕷皂苷高劑量組的腦組織結構與神經細胞明顯恢復正常。

2.3各組大鼠腦組織細胞凋亡情況比較圖2 結果顯示：正常對照組中正常細胞沒有被染色，細胞核呈藍色。與正常對照組比較，模型對照組細胞核呈棕黃色，細胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組細胞凋亡率明顯減小，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織病理變化比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the morphological features of brain tissue of rats in various groups（by HE staining，×200）

2.4各組大鼠腦組織中Caspase-3、Caspase-9活化水平，Bax/Bcl-2比值比較圖3 結果顯示：與正常對照組比較， 模型對照組大鼠腦組織cleaved Caspase- 3/Caspase- 3、 cleaved Caspase- 9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值明顯上調（均P＜0.05）；與模型對照組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組的cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bax/Bcl-2比值明顯下調（均P＜0.05）。

圖2 各組大鼠腦組織細胞凋亡情況比較（TUNEL法）Figure 2 Comparison of the apoptosis of neurons in brain tissue of rats in various groups（by TUNEL assay）

圖3 各組大鼠腦組織中Caspase-3、Caspase-9活化水平，Bax/Bcl-2比值比較Figure 3 Comparison of the activated levels of Caspase-3，Caspase-9 and ratio of Bax/Bcl-2 in brain tissue of rats in various groups

2.5各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較表2結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中的IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10 含量明顯升高（均P＜0.05）；與模型對照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組的血清中IL-6、TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低，IL-10 含量明顯升高（均P＜0.05）。

2.6各組大鼠腦組織ICAM-1表達比較圖4 結果顯示：正常對照組細胞無特異染色。與正常對照組比較，模型對照組細胞中的ICAM-1陽性表達增強（細胞呈棕黃色），ICAM-1陽性表達細胞率升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型對照組比較，薯蕷皂苷中、高劑量組中的細胞ICAM-1陽性表達明顯減弱，ICAM-1 陽性表達細胞率降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10 of rats in various groups [ ± s，ρ/（pg·mL-1）]

表2 各組大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較Table 2 Comparison of the serum contents of IL-6，TNF-α，IL-1β，IL-10 of rats in various groups [ ± s，ρ/（pg·mL-1）]

①P ＜0.05，與正常對照組比較；②P ＜0.05，與模型對照組比較

組別正常對照組模型對照組薯蕷皂苷低劑量組薯蕷皂苷中劑量組薯蕷皂苷高劑量組N/只10 10 10 10 10 IL-6 22.43 ± 4.16 92.08 ± 10.08①87.63 ± 11.54 53.33 ± 7.04②37.17 ± 6.82②TNF-α 38.28 ± 4.82 184.06 ± 22.26①176.47 ± 27.22 102.86 ± 10.06②68.33 ± 9.22②IL-1β 19.25 ± 3.01 113.17 ± 17.08①108.83 ± 21.31 77.16 ± 9.15②39.21 ± 5.87②IL-10 2.08 ± 0.24 3.22 ± 0.35①3.65 ± 0.43 6.18 ± 0.49②11.53 ± 1.56②

圖4 各組大鼠腦組織ICAM-1表達比較Figure 4 Comparison of the ICAM-1 expression in brain tissue of rats in various groups

圖5 各組大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化情況比較Figure 5 Comparison of the activation of HMGB1/TLR4/NF-κB p65 pathway of rats in various groups

2.7各組大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65通路的活化情況比較圖5結果顯示：與正常對照組比較，模型對照組的HMGB1、TLR4相對蛋白表達水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，薯蕷皂苷低、中、高劑量組的HMGB1、TLR4相對蛋白表達水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均顯著降低（P＜0.05）。

3 討論

腦出血發生后會產生一系列繼發的神經損傷，如腦水腫、細胞凋亡等，其中，腦出血周圍水腫是腦出血最常見的并發癥，也是導致神經功能障礙的主要原因[14]。本研究中組織干濕質量法結果顯示，模型對照組的腦含水量較正常對照組明顯增多（P＜0.05），表明急性腦出血大鼠繼發了腦水腫；薯蕷皂苷中、高劑量組的腦含水量較模型對照組明顯減少（P＜0.05），表明薯蕷皂苷可減輕并緩解急性腦出血引起腦水腫的情況。本研究中神經功能評分結果顯示，模型對照組的神經損傷評分及腦指數較正常對照組明顯增高（P＜0.05），表明急性腦出血引起了大鼠的神經功能障礙；薯蕷皂苷中、高劑量組的神經功能評分及腦指數較模型對照組明顯降低（P＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠修復急性腦出血大鼠的神經損傷。

細胞凋亡在腦出血血腫周圍組織神經細胞的變性、死亡的過程中扮演了重要角色[15]。在凋亡過程中，細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）結合，使其形成多聚體，并促使Caspase-9與其結合形成凋亡小體，Caspase-9 被激活[16]，被激活的Caspase-9 激活Caspase-3 誘導細胞凋亡[17]。Bax 蛋白和Bcl-2 蛋白在細胞凋亡調節中同樣起到關鍵的作用，細胞趨于存活還是發生凋亡取決于Bax/Bcl-2蛋白比率，此比率增高，細胞趨向于凋亡，比率降低則細胞趨向于存活[18]。本研究TUNEL 染色結果顯示，模型對照組凋亡細胞較正常對照組明顯增多，薯蕷皂苷中、高劑量組凋亡細胞較模型對照組明顯減少（均P ＜0.05），且Western Blot 檢測結果顯示，模型對照組的Caspase-3、Caspase-9活化水平與Bax/Bcl-2 比值較正常對照組明顯上調，薯蕷皂苷各劑量組的Caspase-3、Caspase-9活化水平與Bax/Bcl-2比值較模型對照組明顯下調（均P ＜0.05）。表明急性腦出血可誘導大鼠神經細胞發生凋亡，薯蕷皂苷能夠抑制大鼠急性腦出血后的神經細胞發生凋亡。

炎性反應在腦出血的病理生理中的重要性越來越受到重視。腦出血炎性反應是腦出血后引起神經損傷的重要原因[19-20]。本研究ELISA 檢測結果顯示，模型對照組血清中的IL-6、TNFα、IL-1β、IL-10含量較正常對照組明顯升高（P ＜0.05），表明急性腦出血誘導機體發生炎癥反應，激活體內免疫應答；薯蕷皂苷中、高劑量組的血清中IL-6、TNF- α 和IL-1β 含量 較 模 型對照 組 明 顯降低，IL-10 含量較模型對照組明顯升高（均P ＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠調節急性腦出血大鼠機體的炎癥反應。

ICAM-1是一種廣泛分布于中樞神經系統中的黏附因子，其能夠影響白細胞黏附、活化，并介導神經組織的炎癥反應[21]。有研究顯示，急性腦出血患者體內的炎癥反應增加，炎癥因子能夠通過血腦屏障進入腦組織，進而上調ICAM-1 的表達[22]。本研究免疫組織化學檢測結果顯示，模型對照組細胞中的ICAM-1陽性表達較正常對照組增強（P ＜0.05），表明急性腦出血可誘導大鼠神經系統的炎癥反應；薯蕷皂苷中、高劑量組中的細胞ICAM-1陽性表達較模型對照組明顯減強（P ＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠減輕急性腦出血大鼠神經系統的炎癥反應。

HMGB1 是一種新型促炎因子，能夠引起其他炎癥因子如TNF-α和IL-6 等表達，引發炎性瀑布反應[23]。HMGB1 發揮細胞外促炎因子的作用主要是通過與晚期糖基化終產物受體和Toll 樣受體家族的TLR4等受體結合，啟動相關信號途徑而刺激NF-κB 發揮致炎效應。NF-κB p65 是NF-κB 的一種亞基組成形式，是一種重要的轉錄因子[24]。研究發現，NF-κB 的活化能夠誘導白細胞黏附分子上調，導致炎癥細胞分泌TNF-α、IL-1β 和IL-6 等促炎癥細胞因子，從而促進炎癥反應，誘導神經元細胞凋亡[25]。腦出血患者HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路呈現被激活的狀態[26]。有研究[27]認為通過抑制HMGB1誘導炎癥反應及下游通路，能夠抑制腦出血引起的神經損傷。本研究Western Blot 檢測結果顯示，模型對照組的HMGB1、TLR4蛋白相對表達水平及p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值較正常對照組均顯著升高（P ＜0.05），表明急性腦出血引起了腦組織HMGB1/TLR4/NF-κBp65 通路的活化，激活炎癥反應；薯蕷皂苷各劑量組的HMGB1、TLR4 蛋白相對表達水平，p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均較模型對照組顯著降低（P ＜0.05），表明薯蕷皂苷能夠抑制急性腦出血大鼠腦組織HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路，進而抑制炎癥反應，減少細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過構建老年SD 大鼠急性腦出血模型，發現薯蕷皂苷可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB p65 通路，進而抑制大鼠血灶周圍神經細胞的凋亡與神經組織的炎癥反應，從而減輕急性腦出血。該結果可為薯蕷皂苷的綜合利用及開發提供理論基礎，但其相關機制尚需深入研究。