關節康片調控白細胞介素6表達促進膝關節損傷修復的機制及相關生物標志物的測定

曹厚然， 馮文俊， 陳昭， 曾意榮

（1.廣東省中醫院，廣東廣州 510120；2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東廣州 510405；3.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東廣州 510095）

膝關節損傷的修復通常根據患者傷情采取不同的方法[1-4]，其中包括藥物保守治療、修復性治療以及重建治療等。但修復性治療和恢復性訓練一定程度上可影響患者的日常工作生活，手術治療包括膝關節鏡檢或全膝關節置換手術后，存在膝關節炎加重及假體周圍感染的風險，需使用抗生素控制感染，甚至需行二次翻修手術，進一步增加了患者的負擔[5-7]。

膝關節損傷屬于中醫學 “筋傷”“骨痹” 的范疇。中醫治療膝關節損傷，可依據辨證分型，重視整體觀念，調節全身氣血運行，緩解局部血液循環，扶助正氣，祛除外邪，達到身體的陰陽平衡，促進損傷的修復[8-10]。關節康片是本院骨科常用的院內制劑，既往臨床觀察與實驗研究發現，該制劑對包括膝關節損傷、膝骨關節炎在內的骨傷具有較好的促進恢復作用[11-16]。然而，目前對于該恢復作用的實驗驗證方法較為簡單，尚缺乏科學、系統、深入和可準確量化的評價方法。既往文獻報道膝關節發生損傷時，損傷部位和血液中白細胞介素6（IL-6）水平發生顯著變化[10，17-19]，故我們推測觀察關節康片干預后機體IL-6 的變化情況，能夠從分子生物學水平闡釋該制劑的功效機制。認為該靶標除可作為腫瘤標記物外，也對機體多種異常狀態和炎癥反應起到準確的標示作用，換言之，當膝關節損傷這種異常狀態存在的情況下，IL-6 水平可能也會產生顯著變化，研究這種變化，對明確相關治療機制具有重要的科學意義[20-22]。同時，IL-6水平發生改變時，血液和體液內存在的多種炎癥因子水平也會發生顯著變化，這些炎癥因子則可作為指標性成分，用于建立關節康片促進膝關節損傷修復功效評價的標志物。基于此假說，進行如下研究：

1 材料

1.1動物SPF 級昆明種小鼠30 只，雌雄各半，體質量（20 ± 2）g，購自廣東省實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2018-0002，動物質量合格證號：440072000066136。于廣東省中醫藥工程技術研究院SPF 級動物實驗室飼養，設施使用許可證號：SYXK（粵）2015-0059。

1.2藥物、試劑與儀器關節康片，由廣州中醫藥大學第一附屬醫院制備，每片0.25 g。酶聯免疫吸附分析（ELISA）活性篩選所用試劑盒購自美國DPC 公司；LXB4（純度98%，批號：ZC-22879）、PGE1（純度98%，批號：ZC-20827）、（±）12-HETE（純度98%， 批號： ZC-22942）、±5（6）DiHET（純度98%，批號：ZC-23000）、PGE2（純度98%，批號：ZC-21245）等對照品購自上海甄準生物科技有限公司；胡椒堿對照品（內標，批號：110775-201706）購自中國食品藥品檢定研究院；ELISA 分析、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）法分析和樣品處理所用二甲基亞砜（DMSO）、乙腈、甲醇、甲酸等試劑均為色譜純，購自德國Merck 公司。Thermo-TSQ Quantum 高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）儀，配備ESI 離子源、Accela 高壓泵-自動進樣器系統（美國Thermo- Fisher 公司）； 色譜柱為AgilentSB-C18（規格2.1 mm × 100 mm，粒徑2.7 μm，美國Agilent 公司）；Varioskan Flash 全波長多功能酶標儀（美國Thermo-Fisher公司）。

2 方法與結果

2.1動物實驗

2.1.1 分組、造模與給藥 將30只小鼠分為空白對照組（6只）和造模組（24只）。空白對照組，不進行任何處理，給予正常飲食。造模組小鼠參考Fang等[1]的方法建立膝關節損傷小鼠模型：給予小鼠腹腔注射10 g/L 戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，置于手術臺上，以0.2 mm 直徑鋼針穿刺，后取出鋼針，用酒精清洗傷口，止血夾止血30 min，注射青霉素（4 萬單位），連續注射7 d。然后將這些造模小鼠分為模型對照組，關節康低、中、高劑量組，每組6 只。模型對照組止血并注射青霉素后，每日給予10 mL生理鹽水灌胃，關節康低、中、高劑量組每日給予450、900、1 800 mg/kg劑量（以藥片粉末質量計，下同）的關節康溶液（藥片粉末溶于生理鹽水后濾過）灌胃，連續7 d。第8 天，將空白對照組小鼠全部處死，其余各組隨機選取3只處死。未處死動物中，原屬模型對照組的小鼠繼續正常飼育（此設為模型對照觀察組），原給予低、中、高劑量關節康溶液的各給藥組停止給藥，正常飼育（此設為關節康低、中、高劑量觀察組），繼續觀察各組小鼠恢復狀況，以能正常行走者示恢復，記錄每只動物恢復的時間，并在確認恢復后處死動物。

2.1.2 ELISA 法檢測小鼠血漿、膝關節勻漿IL-6含量 取各組小鼠血漿和膝關節勻漿液樣品，置于96 孔板中， 每組每個基質3 孔， 參照IL- 6 ELISA試劑盒說明方法處理。應用酶標儀測定，以空白對照組為參比，計算相對表達值。所得結果代入SPSS 17.0統計軟件進行方差分析（ANOVA）檢驗。2.1.3 IL-6 含量檢測結果 圖1 結果顯示：術后第8 天，模型對照組血漿和膝關節勻漿液IL-6 水平較空白對照組明顯升高（P ＜0.01），關節康各給藥組中，除低劑量組，其余2 組的IL-6 水平均較模型對照組顯著上升（P ＜0.01），且有劑量依賴性，同時血漿與膝關節勻漿液中IL-6 水平無顯著性差異（P ＞0.05）。

觀察至恢復的動物中，IL-6 水平相較術后第8 天處死的相同方法處理組回落明顯（P ＜0.01），其結果同樣具有劑量依賴性，血漿與膝關節勻漿液中IL-6水平亦無顯著性差異（P ＞0.05）。

上述結果表明，關節康片可能通過調控體內IL-6表達起到促進膝關節損傷修復的功效。

圖1 各組小鼠血漿、膝關節勻漿IL-6含量比較（x ± s，n = 3）Figure 1 Comparison of IL-6 content in plasma and knee joint homogenate in various groups（x ± s，n = 3）

2.2 LC-MS測定IL-6相關炎癥因子根據研究[22-23]報道，我們選擇了LXB4等5個炎癥因子，建立了LC-MS 同時測定方法，并進行生物樣品分析方法學考察。

2.2 .1 制備IL-6相關炎癥因子混合對照品溶液 取LXB4、 PGE1、（±）12- HETE、 ± 5（6）DiHET、PGE2 對照品，精密稱定，置于同一容量為10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得各對照品含量均為100 μg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取血漿或膝關節勻漿液100 μL，置于Captiva ND 96 孔板（孔徑0.2 μm）中。每個實驗組每個基質各6 孔，每孔精密加入300 μL 含100 ng/mL 胡椒堿（內標）的乙腈，封口后抽濾，濾液收集于接收盤中，封口膜密封，備用。

2.2.3 LC-MS 測定條件 使用ESI 離子源，正負離子同時掃描的選擇離子反應模式（SRM），噴霧電壓3 500 V（正離子）/3 000 V（負離子），霧化室溫度350 ℃，離子傳輸管溫度300 ℃，鞘氣壓力30 psi，輔氣壓力10 psi，各待測炎癥因子的離子對、管徑補償（Tube Length Offset）電壓和碰撞能量（CE）見表1。色譜條件：使用Agilent SB-C18色譜柱，乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫。程序：0 ～1.5 min，5% ～5% A；1.5 ～2.0 min，5% ～100% A； 2.0 ～5.0 min， 100% ～100% A；5.0 ～5.5 min，100% ～5% A；5.5 ～7.5 min，5% ～5% A。進樣量10 μL，柱溫25 ℃。混合對照品和供試品的離子流圖見圖2。

表1 各炎癥因子及內標質譜掃描參數Table 1 Mass scan parameters of various inflammatory factors and internal standard

圖2 各炎癥因子LC-MS離子流圖Figure 2 LC-MS ion current chromatograms for various inflammatory factors

2.2.4 炎癥因子測定方法學考察

2.2.4.1 線性和靈敏度 取混合對照品溶液，分別精密吸取適量至8個1.5 mL離心管中，加生理鹽水適量稀釋，即得各化合物濃度分別為2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL 的溶液。取上述溶液，按 “2.2.2” 項下方法進行處理。按照“2.2.3”項下LC-MS 測定方法進樣分析， 結果代入LC-Quan 軟件（美國Thermo-Fisher 公司）中。以峰面積比為橫軸x，濃度為縱軸y，所得各炎癥因子的回歸方程和相關系數見表3。

為考察靈敏度，取對照品溶液，加生理鹽水逐級稀釋，按 “2.2.2” 項下方法進行處理，按照“2.2.3” 項下LC-MS測定方法進樣分析，至信噪比（S/N）＜10。 結果顯示， 各成分的最低定量限（LLOQ）在0.1 ～1.0 ng/mL 范圍內。為便于考察，將LLOQ 樣品濃度統一定為1.0 ng/mL，平行制備6 份溶液，按照 “2.2.3” 項下LC-MS測定方法進樣分析，記錄各待測物峰面積，計算回收率和回收率的相對標準偏差（RSD，sR）。結果顯示，LLOQ樣品的平均回收率為88.79%～103.91%，sR為5.88%～14.24%。具體結果見表3。

上述結果表明，本研究所建立的LC-MS 方法可在2 ～500 ng/mL 對各待測物進行準確測定，且靈敏度良好。

表3 線性與靈敏度Table 3 Linearity and sensitivity （n = 6）

2.2.4.2 精密度和準確度 取混合對照品溶液，精密吸取適量至1.5 mL 離心管中，精密加入生理鹽水適量，配制成各炎癥因子含量分別為5、50、400 ng/mL的溶液，記為QC樣品，每個濃度平行制備6份。取上述樣品，按 “2.2.2” 項下方法進行處理，按照 “2.2.3” 項下LC-MS 測定方法進樣分析，記錄各待測物峰面積，計算回收率和回收率的sR。結果顯示，樣品的平均回收率為96.27% ～106.08%，sR為2.94% ～10.44%，表明本方法精密度和準確度良好。具體結果見表4。

2.2.4.3 穩定性考察 按 “2.2.4.2” 項下方法制備QC 樣品，共制備4 組，分別按如下方法處理：①常溫穩定性：樣品置于常溫（25 ℃）8 h；②進樣器穩定性：樣品置于LC-MS自動進樣器中（溫度設置為4 ℃）2 h；③凍融穩定性：樣品于-20 ℃凍存，取出融化，如此重復3 個循環；④長期穩定性：樣品于-20 ℃凍存30 d后，取出融化。上述各組樣品完成相應處理后，按 “2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，按照 “2.2.3” 項下LC-MS 測定方法進樣分析，記錄各待測物峰面積，計算回收率和回收率的sR。結果顯示，樣品的平均回收率為90.82% ～106.26%，sR為4.23% ～12.66%，表明本方法所制備的樣品穩定性良好。具體結果見表5 ～表8。

表4 精密度和準確度測定結果Table 4 The detection results of precision and accuracy （ ± s，n = 6）

表4 精密度和準確度測定結果Table 4 The detection results of precision and accuracy （ ± s，n = 6）

化合物LXB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測得濃度[ρ/（ng·mL-1）]4.999 ± 0.306 49.557 ± 4.338 404.158 ± 39.162 4.852 ± 0.409 51.531 ± 4.812 424.310 ± 35.026 4.985 ± 0.400 49.958 ± 1.471 424.310 ± 35.026 4.855 ± 0.507 48.135 ± 3.917 393.755 ± 23.613 4.996 ± 0.313 51.035 ± 5.317 405.169 ± 30.741回收率（p/%）99.98 99.11 101.04 97.04 103.06 106.08 99.69 99.92 106.08 97.10 96.27 98.44 99.91 102.07 101.29 sR/%6.11 8.75 9.69 8.42 9.34 8.25 8.02 2.94 8.25 10.44 8.14 6.00 6.27 10.42 7.59

2.2.4.4 基質效應考察 取混合對照品溶液，按“2.2.4.2” 項下各濃度，加甲醇稀釋制備QC 樣品，取所得溶液，按 “2.2.2” 項下方法制備供試品溶液，按照 “2.2.3” 項下LC-MS 測定方法進樣分析，記錄各待測物峰面積，計算回收率和回收率的sR。結果顯示，樣品的平均回收率為92.61%～106.73%，sR為4.67%～13.13%，表明樣品基質對測定不存在明顯影響。具體結果見表9。

表5 常溫穩定性考察結果Table 5 The results of room temperature stability （ ± s，n = 6）

表5 常溫穩定性考察結果Table 5 The results of room temperature stability （ ± s，n = 6）

化合物LXB4 PGE1（±）12-HETE± 5（6）DiHET PGE2標示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測得濃度[ρ/（ng·mL-1）]4.966 ± 0.291 52.560 ± 5.017 406.960 ± 36.865 4.823 ± 0.354 48.293 ± 2.989 410.566 ± 32.424 4.748 ± 0.265 50.036 ± 3.997 410.210 ± 20.158 4.837 ± 0.236 48.549 ± 3.826 393.401 ± 29.262 5.003 ± 0.418 51.098 ± 4.930 386.905 ± 16.849回收率（p/%）99.32 105.12 101.74 96.45 96.59 102.64 94.96 100.07 102.55 96.73 97.10 98.35 100.06 102.20 96.73 sR/%5.87 9.54 9.06 7.33 6.19 7.90 5.57 7.99 4.91 4.87 7.88 7.44 8.35 9.65 4.35

表6 進樣器穩定性考察結果Table 6 The results of bench-top stability（ ± s，n = 6）

表6 進樣器穩定性考察結果Table 6 The results of bench-top stability（ ± s，n = 6）

化合物LXB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測得濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.038 ± 0.480 48.200 ± 3.650 399.511 ± 26.548 4.972 ± 0.536 51.876 ± 3.666 401.854 ± 47.188 4.552 ± 0.227 48.461 ± 4.593 422.761 ± 28.709 4.743 ± 0.309 49.765 ± 5.019 407.941 ± 39.696 4.943 ± 0.432 52.936 ± 2.105 404.978 ± 39.477回收率（p/%）100.75 96.40 99.88 99.45 103.75 100.46 91.05 96.92 105.69 94.87 99.53 101.99 98.87 105.87 101.24 sR/%9.53 7.57 6.65 10.79 7.07 11.74 4.98 9.48 6.79 6.50 10.09 9.73 8.74 3.98 9.75

2.2.4.5 各組血漿與膝關節勻漿液中IL-6相關炎癥因子含量比較 取 “2.2.2” 項下制備的供試品溶液，按照 “2.2.3” 項下LC-MS 測定方法進樣分析，記錄各待測物峰面積，計算含量并將含量結果代入SPSS 軟件中使用Student-T進行檢驗分析。結果顯示：在空白對照組與術后第8天處死的模型對照組中，各炎癥因子的含量存在明顯差異（P＜0.05 或P＜0.01）；術后第8 天處死的各給藥組中，除低劑量組外，其余2組炎癥因子含量均較模型對照組明顯下降（P＜0.05 或P＜0.01）。各觀察組的測定結果則與空白對照組無明顯差異（P＞0.05）；同一處理組中不同基質的結果存在顯著性差異（P＜0.05），但變化趨勢基本相同。上述結果表明，本研究所選用的5個炎癥因子可以作為評價膝關節損傷及關節康片在其中所起作用的生物指標。具體結果見圖3。

表7 凍融穩定性考察結果Table 7 The results of freeze-thaw stability（ ± s，n = 6）

表7 凍融穩定性考察結果Table 7 The results of freeze-thaw stability（ ± s，n = 6）

化合物LXB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測得濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.204 ± 0.578 49.476 ± 3.730 386.093 ± 38.184 5.083 ± 0.371 47.966 ± 5.115 412.592 ± 21.787 5.176 ± 0.464 49.728 ± 2.105 390.002 ± 41.237 4.976 ± 0.482 49.394 ± 3.608 403.609 ± 25.532 4.865 ± 0.345 46.815 ± 3.015 388.563 ± 35.582回收率（p/%）104.07 98.95 96.52 101.65 95.93 103.15 103.53 99.46 97.50 99.53 98.79 100.90 97.30 93.63 97.14 sR/%11.10 7.54 9.89 7.29 10.66 5.28 8.96 4.23 10.57 9.68 7.30 6.33 7.09 6.44 9.16

表8 長期穩定性考察結果Table 8 The results of long-term stability （ ± s，n = 6）

化合物LXB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測得濃度[ρ/（ng·mL-1）]4.951 ± 0.470 53.128 ± 3.227 381.295 ± 48.286 4.938 ± 0.381 50.389 ± 5.229 402.506 ± 26.958 4.957 ± 0.395 51.134 ± 3.026 397.357 ± 41.768 5.081 ± 0.463 49.947 ± 4.537 363.299 ± 30.095 4.884 ± 0.227 47.769 ± 5.028 408.560 ± 40.111回收率（p/%）99.02 106.26 95.32 98.75 100.78 100.63 99.14 102.27 99.34 101.62 99.89 90.82 97.67 95.54 102.14 sR/%9.50 6.07 12.66 7.71 10.38 6.70 7.96 5.92 10.51 9.10 9.08 8.28 4.64 10.53 9.82

表9 基質效應考察結果Table 9 The results of matrix effect （ ± s，n = 6）

表9 基質效應考察結果Table 9 The results of matrix effect （ ± s，n = 6）

化合物LXB4 PGE1（±）12-HETE±5（6）DiHET PGE2標示濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000 5.000 50.000 400.000測得濃度[ρ/（ng·mL-1）]5.169 ± 0.662 49.475 ± 5.305 412.456 ± 19.250 5.132 ± 0.451 49.591 ± 2.847 425.809 ± 19.964 5.337 ± 0.378 50.113 ± 4.296 396.538 ± 52.049 5.243 ± 0.237 46.305 ± 2.259 425.273 ± 48.700 5.161 ± 0.415 48.330 ± 4.537 385.689 ± 37.530回收率（p/%）103.39 98.95 103.11 102.63 99.18 106.45 106.73 100.23 99.13 104.86 92.61 106.32 103.22 96.66 96.42 sR/%12.81 10.72 4.67 8.78 5.74 4.69 7.08 8.57 13.13 4.52 4.88 11.45 8.04 9.39 9.73

3 討論

關節康片是以熟地、補骨脂、杜仲、枸杞子、丹參、川芎、紅花等中藥配伍而成的制劑，旨在補腎壯骨，活血止痛，以治療膝骨關節炎等膝關節損傷疾患[11]。本研究結果顯示，關節康片可明顯加速小鼠膝關節損傷的康復，縮短其恢復正常行走的時間。

圖3 各組血漿和膝關節勻漿液中IL-6相關炎癥因子含量比較（n = 6）（ ± s）Figure 3 Comparison of the contents of IL-6-related inflammatory factors in plasma and knee joint homogenate in various groups（n = 6）（ ± s）

IL-6 是參與骨髓間充質干細胞軟骨定向分化的重要調節因子，有研究表明，IL-6 與膝骨關節炎的發生相關[23-24]。本研究結果亦顯示，IL-6表達與膝關節損傷之間存在關聯性。當機體發生膝關節損傷時，血漿與膝關節勻漿液IL-6 表達被激活，抑制膝關節損傷部位壞死；在手術后和自然修復過程中，IL-6 水平逐漸降低至正常；服用關節康片后，IL-6 水平出現上升，停藥后恢復正常。說明該制劑可能通過刺激IL-6 釋放和在膝關節損傷部位富集促進膝關節損傷修復，故認為該指標可以作為評價膝關節損傷及修復的重要參考。

針對IL-6指標，目前主要采用ELISA法或RTPCR法進行測定，但此2種方法存在準確度不夠的問題，而基于該指標成分的理化特性，目前尚無更為精密、準確的儀器方法可對其進行分析。為解決上述問題，基于文獻調研結果[13-15]，筆者提出測定IL-6 相關體內炎癥因子用于評價不同實驗組IL-6水平的方法，所選取的指標成分既有市售對照品，又可使用LC-MS 進行同時、快速、準確的測定。

本研究選擇的5 個炎癥因子與體內IL-6 水平密切相關。既往代謝組學研究結果[21]顯示，拔罐后實驗動物血液和周圍皮膚組織中，上述內源性代謝物水平明顯高于對照組。且這些成分均為文獻報道較多的調控炎癥脂質介質，在其水平顯著變化時，IL-6 水平也會隨之出現明顯變化，上述情況在病變/損傷部位尤為明顯[22-23]。因此選擇LXB4等5個炎癥因子作為本研究的療效評價指標具有較好的科學性和針對性。

本研究對不同基質（血漿、膝關節勻漿液）中各炎癥因子水平的測定結果表明，其變化趨勢基本相同。產生上述情況的原因，可能與損傷修復的機制有關，即可將損傷修復看作代謝反應，血液則在其中扮演了中介和傳輸管道的作用，IL-6則通過血液循環到達受體產生反應。在臨床實踐中，由于患者膝關節組織和關節液取樣極為困難，血液中炎癥因子水平的指向性作用，可以大幅降低病程和療效評價的難度，實現對治療全過程更為精準的把控。

綜上所述，本研究闡釋了血漿與膝關節勻漿液中的IL-6 水平與膝關節損傷及其修復的關聯性，并以此說明了關節康片促進膝關節損傷修復的機制。同時通過測定IL-6 相關炎癥因子探討了產生這一機制的生物學基礎，并建立了快速、準確、可量化的評價方法，可以為膝關節損傷和修復過程以及關節康片的功效評價提供研究經驗和科學依據。