基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測金錢草治療泌尿系結(jié)石的作用機(jī)制

黃麗， 孫曉靜， 孫治中， 陳慧玲， 謝建興， 崔學(xué)教

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

泌尿系結(jié)石是常見的泌尿系統(tǒng)疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界泌尿系結(jié)石的發(fā)病率已達(dá)11%～15%[1]，且有逐年升高的趨勢。雖然體外沖擊波碎石、經(jīng)皮腎鏡碎石取石、輸尿管鏡碎石取石等微創(chuàng)手術(shù)已經(jīng)廣泛采用并取得較好的治療效果，但泌尿系結(jié)石的復(fù)發(fā)率仍比較高[2]。中醫(yī)藥治療泌尿系結(jié)石有良好的療效。崔學(xué)教教授認(rèn)為，治當(dāng) “唯重利尿”，同時(shí)也特別注意固護(hù)正氣。通淋排石藥多為寒涼之品，久服必傷陽氣，故崔老臨證運(yùn)用利尿之法，多首選藥性較平的金錢草。金錢草是治療泌尿系結(jié)石的常用中藥，具有抗結(jié)石生成、利尿、抗炎和減輕輸尿管張力的作用。但目前針對金錢草的研究局限于單一成分、單靶點(diǎn)，其具體機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在生物信息學(xué)、多向藥理學(xué)[3]、系統(tǒng)生物學(xué)[4]的基礎(chǔ)上，通過多成分-多靶點(diǎn)-多通路更加系統(tǒng)地探討中藥及方劑對相關(guān)疾病作用機(jī)制的研究方法[5]。故本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測金錢草治療泌尿系結(jié)石的靶點(diǎn)、通路富集分析以探討其作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1活性成分的獲取以 “金錢草” 為檢索詞，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索其化學(xué)成分，將口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩查出符合條件的活性成分，點(diǎn)擊其成分的詳細(xì)信息，保存活性成分的2D結(jié)構(gòu)。

1.2預(yù)測金錢草相關(guān)靶點(diǎn)在Pubchem 中檢索篩選出的活性成分，找出它們對應(yīng)的smile 號，保存為SDF 文件，上傳至SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）， 基 于 反 向分子對接原理，依據(jù)成分的2D/3D結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，得到金錢草的預(yù)測靶點(diǎn)。

1.3泌尿系結(jié)石相關(guān)靶點(diǎn)的獲取及與金錢草預(yù)測靶點(diǎn)的映射以 “Urinary Calculus” 為檢索詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取泌尿系結(jié)石相關(guān)靶點(diǎn)。將金錢草的預(yù)測靶點(diǎn)與泌尿系結(jié)石相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射得到金錢草治療泌尿系結(jié)石的預(yù)測靶點(diǎn)。

1.4蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過String 數(shù)據(jù)庫設(shè)定物種為 “Homo snpiens” 獲取全部蛋白-蛋白相關(guān)作用關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，生成背景網(wǎng)絡(luò)。在背景數(shù)據(jù)庫選中上述映射得到的金錢草作用于泌尿系結(jié)石的靶點(diǎn)，并找到與其直接相連的節(jié)點(diǎn)，作為金錢草治療泌尿系結(jié)石的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取通過Cytoscape 3.6.0 軟件Tools 模塊中NetworkAnalyzer- Network Analysis-Analyze Network 進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析獲取相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，選取節(jié)點(diǎn)連接度（Degree）的二倍中位數(shù)、節(jié)點(diǎn)介度（Betweenness）和節(jié)點(diǎn)緊密度（Closeness）的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，提取出Hub網(wǎng)絡(luò)。

1.6基因本體論（GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析應(yīng)用Cytoscape 3.6.0 軟件中的ClueGO 插件，選擇BiologicalProcess（生物進(jìn)程），對Hub網(wǎng)絡(luò)中的靶標(biāo)進(jìn)行GO富集分析。通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站對上述分析結(jié)果進(jìn)行KEGG通路分析并進(jìn)行篩選，得到顯著富集（P＜0.01）的通路，并按照基因（Gene）數(shù)從大到小排序，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出治療泌尿系結(jié)石的可能通路，找到其通路上的相關(guān)靶標(biāo)。結(jié)合金錢草的活性成分，構(gòu)建出金錢草活性成分-泌尿系結(jié)石靶標(biāo)-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)圖。將篩選出來的20 條相關(guān)通路，繪制成KEGG 通路富集分析柱狀圖。

1.7分子對接驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力運(yùn)用systems Dock 網(wǎng) 站（http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）對Degree值排名前5位的預(yù)測靶標(biāo)與金錢草活性成分進(jìn)行分子對接，通過比較與原生配體的結(jié)合分值大小來評價(jià)結(jié)合的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1金錢草活性成分本研究將OB ≥30%、DL ≥0.18 作為活性成分篩選條件，篩選出活性化合物10 種，化合物名稱、相關(guān)參數(shù)及化學(xué)結(jié)構(gòu)式見表1。

表1 金錢草活性成分Table 1 Data of active ingredients from Herba Lysimachiae

2.2金錢草預(yù)測靶點(diǎn)以及活性成分-泌尿系結(jié)石靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建在SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫中篩選出10 種活性化合物對應(yīng)的135 個(gè)靶點(diǎn)，依據(jù)成分的2D/3D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，篩選出98 個(gè)靶點(diǎn)作為金錢草的預(yù)測靶點(diǎn)。將所得的金錢草預(yù)測靶點(diǎn)與GeneCards 數(shù)據(jù)庫獲取的1 043 個(gè)泌尿系結(jié)石相關(guān)靶點(diǎn)相映射，篩選出金錢草可能與泌尿系結(jié)石相關(guān)的靶點(diǎn)21個(gè)。在Cytoscape 3.6.0軟件中導(dǎo)入金錢草的活性成分與泌尿系結(jié)石相關(guān)的靶點(diǎn)，構(gòu)建金錢草活性成分-泌尿系結(jié)石靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）。如圖1 可見，此網(wǎng)絡(luò)中共包括76 個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中，包括9個(gè)化合物，21個(gè)靶點(diǎn)，91個(gè)邊。

圖1 金錢草活性成分-泌尿系結(jié)石靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Network of Herba Lysimachiae active ingredients- urinary calculus targets

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將21 個(gè)金錢草可能與泌尿系結(jié)石相關(guān)的靶點(diǎn)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫得到蛋白-蛋白相關(guān)作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.6.0 軟件，形成金錢草治療泌尿系結(jié)石的PPI網(wǎng)絡(luò)（見圖2）。如圖2顯示，此網(wǎng)絡(luò)中共包括192 個(gè)節(jié)點(diǎn)，965 個(gè)邊。圖中節(jié)點(diǎn)大小是按Degree 值的大小形成，Degree 值越大，節(jié)點(diǎn)越大。

圖2 金錢草治療泌尿系結(jié)石的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 2 PPI network of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.4 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取及Hub中的靶標(biāo)選取Degree的二倍中位數(shù)、Betweenness 和Closeness 的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，通過Cytoscape 3.6.0 軟件得到Hub中的靶標(biāo)，即金錢草治療泌尿系結(jié)石的關(guān)鍵靶點(diǎn)，提取出Hub 網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。關(guān)鍵靶點(diǎn)共8 個(gè)，按照Degree 值從大到小排序分別為表皮生長因子受體（EGFR）、雌激素受體1（ESR1）、醛糖還原酶（AR）、表皮生長因子受體2（ERBB2）、雌激素受體2（ESR2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、肝X受體β（NR1H2）、血清鈣（CA2）。

圖3 金錢草治療泌尿系結(jié)石的Hub網(wǎng)絡(luò)Figure 3 Hub network of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.5 GO富集分析應(yīng)用Cytoscape 3.6.0 軟件中ClueGO插件，進(jìn)行GO富集中的生物進(jìn)程分析，得到11 個(gè)功能組別（見圖4）以及其占比餅狀圖（見圖5）。

圖4 金錢草治療泌尿系結(jié)石GO富集分析功能組別圖Figure 4 Diagram for GO enrichment analysis of functional groups Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

圖5 金錢草治療泌尿系結(jié)石的GO富集分析功能組別占比餅狀圖Figure 5 Pie chart for GO enrichment analysis of functional group proportion in Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.6 KEGG通路分析通過KEGG 通路分析得到126條通路，結(jié)合文獻(xiàn)檢索，篩選出金錢草治療泌尿系結(jié)石的可能通路為8條，繪制KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖6）。主要分為2 類：①泌尿系炎癥及黏膜相關(guān)通路：磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號通路、血趨化因子信號通路、核因子E2相關(guān)因子2/ Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Nrf2/Keap1）信號通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）信號通路、酪氨酸激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）信號通路等；②尿鈣相關(guān)通路：核因子κB（NF-κB）信號通路、辣椒素受體5（TRPV5）信號通路。

圖6 金錢草治療泌尿系結(jié)石的KEGG通路富集分析柱狀圖Figure 6 Histogram for KEGG pathway enrichment analysis of Herba Lysimachiae treatment for urinary calculus

2.7構(gòu)建金錢草活性成分-泌尿系結(jié)石靶標(biāo)-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)圖將上述8條相關(guān)通路，找到其通路上的相關(guān)靶標(biāo)，結(jié)合金錢草的活性成分，構(gòu)建出金錢草活性成分-泌尿系結(jié)石靶標(biāo)-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖7）。

2.8分子對接運(yùn)用systems Dock 網(wǎng)站對Degree值排名前5位的預(yù)測靶標(biāo)與金錢草活性成分進(jìn)行分子對接，根據(jù)Docking Score值的大小應(yīng)用GraphPiad Prism 7.0 軟件制作出熱圖（見圖8）。Docking Score值在4.25 以上認(rèn)為分子與靶點(diǎn)有一定的結(jié)合活性，大于5.0 說明有較好的結(jié)合活性，大于7.0 說明具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。熱圖結(jié)果顯示，大部分Docking Score值高于4.25，提示金錢草活性成分與預(yù)測靶標(biāo)有一定的結(jié)合能力。

圖7 金錢草活性成分-泌尿系結(jié)石靶標(biāo)-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)圖Figure 7 Multiple compound-target-pathway network of Herba Lysimachiae

圖8 金錢草治療泌尿系結(jié)石預(yù)測靶標(biāo)及活性成分分子對接熱圖Figure 8 Molecular docking heat map for predicted targets and active components

3 討論

目前，針對金錢草治療泌尿系結(jié)石的研究局限于單一成分、單靶點(diǎn)，其具體機(jī)制尚不明確，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從分子水平對其作用機(jī)制進(jìn)行探討分析。

3.1金錢草治療泌尿系結(jié)石的關(guān)鍵靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果表明，金錢草治療泌尿系結(jié)石的關(guān)鍵靶點(diǎn)有8 個(gè)，具體為EGFR、ESR1、AR、ERBB2、ESR2、MMP-2、NR1H2、CA2。有研究表明：EGFR 能延緩腎小管細(xì)胞的壞死程度，在腎損壞中起保護(hù)性作用[6]；ESR1 能抑制草酸引起的腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及抑制結(jié)石相關(guān)炎癥介質(zhì)的表達(dá)[7]；AR活性升高，會(huì)導(dǎo)致腎臟細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變，進(jìn)一步加重腎臟功能損害[8-9]；ERBB2 在腎臟纖維化中發(fā)揮著重要的作用[10]；在結(jié)石導(dǎo)致的急性腎功能損傷中，MMP-2 及炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)，血液水平上升，參與炎癥反應(yīng)及腎小球、腎小管基底膜的降解[11]；CA2升高，尿鈣沉積，是腎結(jié)石形成的重要原因之一，長期高鈣血癥可能造成腎小管功能失衡[12]。

3.2金錢草治療泌尿系結(jié)石的炎癥及黏膜相關(guān)通路金錢草治療泌尿系結(jié)石的炎癥及黏膜相關(guān)通路有PI3K-Akt 信號通路、血趨化因子信號通路、Nrf2/Keap1 信號通路、P38MAPK 信號通路、JAK/STAT 信號通路等。PI3K /Akt 信號通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和凋亡中起重要作用[13]。多種酶、細(xì)胞因子、蛋白等通過調(diào)節(jié)PI3K /Akt 信號通路在抑制炎性反應(yīng)及血管增生中發(fā)揮抗腎小球足細(xì)胞衰亡的作用，從而達(dá)到修復(fù)急性腎功能損傷的功效[14]。血趨化因子不僅可以介導(dǎo)趨化、誘導(dǎo)細(xì)胞粘附、促進(jìn)細(xì)胞生長，還具有參與全身炎癥免疫反應(yīng)等生物學(xué)功能[15]，故其可能具有調(diào)節(jié)泌尿系結(jié)石引發(fā)的腎盂腎炎的作用。Kong等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2基因缺失不僅可以加重單純輸尿管梗阻引起的腎損害，還可以在后期加重腎纖維化的進(jìn)程，同時(shí)，Nrf2除了抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而下調(diào)腎臟炎癥反應(yīng)以外，還可直接抑制NF-κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[17-18]。P38MAPK信號通路影響草酸、草酸鈣晶體誘導(dǎo)的大鼠腎臟氧化應(yīng)激和炎癥損傷反應(yīng)、腎臟局部RAS 系統(tǒng)改變、腎臟緊密連接的改變，從而起到抑制草酸鈣結(jié)石生成和保護(hù)腎功能的作用[19]。JAK/STAT 信號通路是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要信號通路之一，在多種泌尿系疾病包括泌尿系結(jié)石中具有調(diào)控作用[20]。

3.3金錢草治療泌尿系結(jié)石的尿鈣相關(guān)通路金錢草治療泌尿系結(jié)石的尿鈣相關(guān)通路包括NF-κB信號通路、TRPV5 信號通路。盧宇超[21]研究表明，通過激活NF-κB 信號通路，引起其下游黏附分子增加，從而介導(dǎo)草酸鈣晶體在腎小管上皮細(xì)胞胞膜表面的粘附及增長。TRPV5 信號通路在調(diào)控尿鈣水平中發(fā)揮重要的作用[22]，TRPV5的表達(dá)與尿鈣與泌尿系結(jié)石的發(fā)生率成負(fù)相關(guān)[23]，其表達(dá)下降或缺乏可使腎小管對鈣的重吸收減少，進(jìn)而產(chǎn)生高鈣尿，尿鈣飽和析出，形成泌尿系結(jié)石。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選金錢草的主要成分，并對靶標(biāo)、通路進(jìn)行功能分析，最后采用分子對接技術(shù)驗(yàn)證金錢草與泌尿系結(jié)石關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合，預(yù)測了金錢草治療泌尿系結(jié)石的分子作用機(jī)制。結(jié)果顯示：金錢草通過多靶點(diǎn)、多通路治療泌尿系結(jié)石，可能在炎癥及黏膜相關(guān)通路、尿鈣相關(guān)通路上起作用。基于此，今后在臨床中可進(jìn)一步研究金錢草在泌尿系感染、結(jié)石成分破壞與分解方面的作用機(jī)制，并進(jìn)行金錢草制劑的開發(fā)工作。另外，在現(xiàn)代中藥復(fù)方中普遍存在 “多向藥理學(xué)” 效應(yīng)和 “疊加” 效應(yīng)，也可對中藥復(fù)方的組成、質(zhì)量控制和作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步深入研究。