電針對胰島素抵抗大鼠氧化應激狀態及線粒體形態結構的影響*

張婧怡，李 瑞△，曹昺焱，宋姍姍，金永祚，金奉奎，段浩茹

(1.北京中醫藥大學，北京 100029； 2.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)又稱為非胰島素依賴性糖尿病，臨床以慢性高血糖為主要癥狀，常合并多個代謝綜合征，如高血壓、高血脂，對人體危害性極大。根據2017年中國2型糖尿病防治指南[1]，我國患病率高達10.4%。現代醫學主要以降糖藥物如二甲雙胍、α-糖苷酶抑制劑或胰島素注射等手段對患者血糖進行控制，易有諸多不良反應或藥物耐受等情況，且醫療支出高昂，對國家或地區經濟發展不利。針灸療法已被證實可有效降低T2DM患者血糖[2]，且具有高效、價廉和副作用小等優點，臨床應用價值極高。

胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)是T2DM的主要致病因素及病理生理學特征[3]，直接引起胰島素調控葡萄糖代謝能力下降。氧化應激(Oxidativestress,OS)可通過激活蛋白激酶C[4]、cJun氨基末端激酶通路[5]和核轉錄因子[6]等多途徑，干擾胰島素信號通路，并且破壞線粒體形態功能，是引起IR的重要因素之一。本研究將選取優勢經驗穴組，通過對T2DM大鼠血糖、自由基和抗氧化因子水平分析，結合電鏡觀察骨骼肌線粒體結構，研究電針對2型糖尿病大鼠氧化應激、線粒體形態結構及胰島素抵抗狀態的影響，探討電針治療2型糖尿病的治療機制。

1 實驗方法

1.1 實驗動物

選取7只2月齡體質量為140～160 g的SPF級雄性非糖尿病大鼠(Zucker lean,ZL)(fa/+)及14只2月齡同體質量的SPF級雄性Zucker糖尿病肥胖大鼠(Zucker diabetic fatty rat,ZDF) (fa/fa)。兩種大鼠皆購自北京維通利華公司[許可證號SCXK(京)2016-0006]。實驗大鼠均于室溫23°C，空氣流通良好，相對濕度50%～60%，且12 h晝夜循環光照環境下進行飼養。適應性飼養4周，期間全部大鼠自由飲食水。

1.2 實驗材料及儀器

ACCU-CHEK血糖儀(德國羅氏公司，LOT 10129770);羅氏血糖試紙(LOT 24685431);Purina #5008飼料(粗蛋白≥23.0%，粗脂肪≥6.5%，粗纖維≤4.0%，高糖高脂飼料);中研太和牌針灸針0.13 mm×7 mm(212161123，北京中研太和醫療器械有限公司);采血針(華鴻牌);電針儀(英迪牌電針儀);自制鼠套等。

1.3 模型建立與分組

適應性飼養后，全部大鼠均改為Purina #5008飼料持續喂養。4周誘導飼養后，取大鼠尾尖靜脈血，測其空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)及口服葡萄糖耐量試驗2 h血糖(OGTT2h)，以二者血糖均>11.1 mmol/L為造模成功標準。根據FBG水平將成模的ZDF大鼠隨機區組，分為模型組、電針組兩組。7只ZL大鼠為空白組。

1.4 干預方法

1.4.1 空白組及模型組 不干預。

1.4.2 電針組 將大鼠固定于自制棉鼠套靜置5 min，針刺雙側“后三里”“三陰交”“脾俞”“胃脘下俞”，并連通電針儀，電針一端連接于“后三里”，一端連接同側“胃脘下俞”，以連續波、頻率15 Hz、電流輸出強度2 mA刺激穴位，留針20 min，每日1次，共4周，第7、14、21、28天不進行干預。

以上各種干預操作均于每日13:00—18:00期間進行，連續干預4周。于干預第6、13、20、27天晚20:00禁食，次日早8:00檢測空腹體重、血糖。

1.5 指標檢測

所有動物全部干預結束后，自由飲食水，于實驗結束當晚22:00禁食，次日早8:00以2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量比腹腔注射麻醉，腹主動脈取血5～10 mL離心管中，室溫靜置凝固后，于4℃條件下3 000 r/min離心15 min分離血清，運用全自動生化分析儀檢測：總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的含量。

1.6 胰島素抵抗指數

根據胰島素抵抗指數(Homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)計算公式：HOMA-IR=(空腹血糖×空腹胰島素)/22.5，計算各組大鼠全部干預結束后胰島素抵抗指數。

1.7 統計分析

2 實驗結果

2.1 各組大鼠FBG比較

由表1可知，造模前后，模型組與電針組大鼠FBG差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。造模后模型組與電針組較空白組FBG明顯升高(P<0.05)，提示造模成功。全部干預結束后，模型組與電針組較空白組FBG值仍有升高(P<0.05)；模型組較電針組FBG值差異無統計學意義(P>0.05)，但全部干預后電針組FBG較干預前FBG有所降低(P<0.01)，差異具有統計學意義，而全部干預結束后模型組FBG較干預前FBG差異無統計學意義(P>0.05)，顯示電針組具有一定降糖效果。

表1 各組大鼠造模前后與全部干預后FBG比較

2.2 各組大鼠全部干預后HOMA-IR比較

由表2可知,與空白組比較，模型組、電針組HOMA-IR值明顯升高(P<0.01)，模型組與電針組差異無統計學意義(P>0.05)，結合MS比較，電針組HOMA-IR略低于模型組。

表2 各組大鼠全部干預后HOMA-IR比較

2.3 各組大鼠血清T-AOC、ROS、MDA和SOD水平比較

由表3可知，模型組、電針組與空白組相比，T-AOC、SOD降低(P<0.05)，ROS、MDA均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組ROS、MDA有所減少(P<0.05)，T-AOC較之增加(P<0.05)。而二者間SOD差異無統計學意義(P>0.05)，但結合MS分析，電針組SOD略高于模型組。

2.4 各組大鼠股四頭肌線粒體電鏡觀察

通過電鏡觀察可知，空白組大鼠股四頭肌線粒體多呈長橢圓形，線粒體嵴清晰，結構完整，排列緊密；模型組線粒體出現不同程度結構缺失，線粒體嵴模糊，結構松散，排列稀疏松散，甚至部分呈空泡狀；電針組較模型組有所改善，大部分線粒體結構正常，有部分嵴模糊，但基本具有完整結構。見圖1。

表3 各組大鼠血清T-AOC、ROS、MDA和SOD水平比較

圖1 電鏡下各組大鼠股四頭肌線粒體(120 000×)

3 討論

氧化應激是指機體遭受有害刺激后，體內活性氧(ROS)等自由基產生過多導致組織損傷[7]，而ROS主要來源之一就是線粒體。線粒體是機體最重要的能量供應中心，提供了生命活動所需的90%三磷酸腺苷(ATP)。在合成ATP過程中，部分氧分子被還原成ROS。正常狀態下，機體內具有完善的抗氧化系統，自由基與抗氧化因子保持著動態平衡，如超氧化物歧化酶(SOD)，可與O2-發生反應，將對機體有害的自由基轉化為無害的H2O和O2，有效控制體內自由基水平[8]。而病理狀態下，ROS過量產生，其水平超出氧化物清除能力，氧化系統和抗氧化系統失衡，可引起生物膜結構及其功能被破壞，最終降解為丙二醛(MDA)[9]。另一方面，由于線粒體結構獨特，其DNA幾乎全部由編碼區構成，沒有保護蛋白，也是ROS主要攻擊對象。OS狀態下，ROS可直接干擾線粒體DNA、RNA復制，破壞線粒體形態結構，引起線粒體功能障礙[10]。而線粒體結構被破壞，又會增加ROS產生，形成惡性循環。由于ATP是人體能直接利用的唯一能源，且90%以上由線粒體的氧化磷酸化過程產生。線粒體結構、功能損傷會導致其對葡萄糖的氧化分解減少、ATP生成減少，機體能量供應不足，在宏觀上表現為胰島素抵抗和高血糖狀態[11]。

臨床上，針灸已被廣泛應用于治療2型糖尿病患者[12]，且對胰島素抵抗狀態有明顯改善作用。李海燕等[13]通過實驗，驗證了針灸可降低人體膽固醇、甘油三酯和HOMA-IR等指標。在治療氧化應激方面，也有多個研究表明[14-16]，針灸具有良好抗氧化作用，可以有效降低機體MDA水平，提高SOD活性及其水平，調節機體內氧化與抗氧化因子的平衡，緩解氧化應激。同時，針灸也可保護機體線粒體，高明等[17]發現針刺對線粒體結構形態、數量有明顯的正向影響。李強等[18]對IR狀態下的大鼠進行針刺干預，結果顯示針刺組較模型組ATP生成量增加，說明針灸提高了線粒體合成ATP能力，保護了線粒體正常形態及功能。

《靈樞·本臟》曰：“脾脆則善病消癉易傷”，說明消渴與中焦脾胃關系極為密切，脾胃失常可多方面影響機體，最終發為消渴。脾為后天之本，負責運化水谷，輸布水谷精微，且脾主肌肉，這與現代研究中骨骼肌承擔80%葡萄糖的攝取及代謝不謀而合[19]。同時，脾虛者因其運化水谷能力減弱，四肢百骸不得滋養而易乏力，也與2型糖尿病患者常見乏力癥狀相符。在IR狀態下，線粒體形態結構被破壞，葡萄糖進入細胞后代謝過程出現障礙，機體ATP生成減少，生命活動所需能量減少，易產生乏力、倦怠。因此，本研究中選取了足三里、脾俞、胃脘下俞3穴進行針灸刺激。足三里、脾俞，一為胃經要穴，一為背俞穴，可直接調理脾胃，改善機體水谷運化，調節氣機；《難經》記載:“脾重二斤三兩，扁廣三寸，長五寸，有散膏半斤”，結合現代解剖學分析，中醫之脾也包括胰腺，即“散膏”也，因此選取胃脘下俞調節脾胃功能，且胃脘下俞也為治療消渴經驗用穴；三陰交為肝、脾、腎三陰經交會穴，肝藏血，脾統血，腎藏精，精血相生，對與血相關的疾病有明顯治療作用。

本研究中，經電針刺激后三里、脾俞、胃脘下俞、三陰交4穴后，電針組大鼠較模型組：T-AOC升高(P<0.05)，抗氧化因子SOD含量也有所提高，反之ROS、MDA降低(P<0.05)，說明電針可緩解機體氧化應激狀態。從電鏡觀察可知，電針組大部分線粒體嵴清晰，細胞器膜完整，分布緊密，說明氧化應激得到緩解后，骨骼肌線粒體形態結構受損程度減輕。與此同時，這也使得線粒體途徑產生ROS減少，形成良性循環。通過分析比較兩組HOMA-IR可知，電針組胰島素抵抗狀態較模型組有所改善，證實了氧化應激與胰島素抵抗存在關聯性，且電針可減緩IR。比較兩組血糖，可發現電針組血糖得到良好控制(P<0.05)，明顯優于模型組，電針具有顯著改善2型糖尿病大鼠血糖作用。

綜上所述，電針可通過調控氧化-抗氧化系統平衡，緩解氧化應激狀態，由此保護線粒體免受氧化應激損傷，維護線粒體正常形態結構，減少其功能障礙、數量減少，增加2型糖尿病大鼠葡萄糖代謝能力，以此改善胰島素抵抗、降低血糖。