冰凍核酸標本質量控制對檢測結果的影響①

劉 靜,陳 巖

(佳木斯市中心血站 檢驗科，黑龍江 佳木斯 154002)

核酸檢測技術(nu-cleic acid amplification testing,NAT)是一新興的血液傳染病檢測方法，能顯著縮短血液感染病毒的“窗口期”，降低經輸血途徑傳播病毒的風險[1]。隨著血站血液篩查實驗室將血液核酸檢測技術的引入，核酸檢測已經成為確保血液安全性的重要技術之一。分析前的質量控制包括病人準備、標本采集儲存及運輸等過程[2]。做好核酸檢測分析前的質量控制才能使核酸檢測更安全可靠。我市中心血站是中小型血站，標本量小，實驗室周末不進行實驗，周五周六采集的標本需凍存，待周一酶免檢測完成后，周二進行核酸檢測。另外我站還承擔3個中心血庫的核酸集中檢測工作，3個血庫路途遙遠，不能每日及時送檢至本站，部分核酸標本需要冰凍，所以做好冰凍核酸標本的質量控制尤為重要。本血站在做好冰凍核酸標本的質量控制下，對冰凍核酸樣本檢測結果進行了綜合分析評價，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源

2016-01～2017-12獻血者血液核酸檢測標本。2016～2017年佳木斯市中心血站共檢測無償獻血者核酸標本47753人次，共拆分64次，取512份標本作為實驗組。實驗組的512份核酸標本拆分實驗結束后凍存在-30℃以下72h以上，作為對照組。實驗前1h放置室溫平衡、復融進行核酸檢測。

1.2 檢測方法

1.2.1 儀器: 浩源核酸匯集提取系統(ChiTas BSS1200)；ABI7500擴增儀；松下醫用低溫箱(MDF-U5412N)。

1.2.2 試劑: 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 人類免疫缺陷病毒(1型)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)試劑盒；HBV DNA 標準物質、HCV RNA 標準物質、HIV RNA 標準物質(康徹斯坦生物)。

1.3 檢測方法

實驗組：對日常ELISA檢測陰性的標本進行核酸8人份混合樣本模式進行檢測，若混樣檢測反應性，再進行拆分，即核酸單檢，單檢呈反應性判斷為NAT陽性，單檢呈無反應性判斷為陰性。混樣檢測反應性，再進行拆分的標本入組。拆分的標本號及檢測結果進行記錄。

對照組：將實驗組的標本凍存72h以上進行單檢，單檢呈反應性判斷為NAT陽性，單檢呈無反應性判斷為陰性。標本號及檢測結果進行記錄。

1.4 數據統計

統計實驗組和對照組的陰陽性實驗結果和標本號，檢出的陰陽性實驗結果和標本號一致，無差異 。

2 結果

2.1 實驗組和對照組陽性結果比較

2016～2017年混樣檢測反應性，再進行拆分的標本凍存后進行檢測，檢出的陽性標本實驗結果無差異(P>0.05)。見表1。

表1 2016～2017年實驗組和對照組數據

2.2 NAT檢測結果統計

2016～2017年佳木斯市中心血站共檢測無償獻血者核酸標本47753人次，共拆分64次，拆分率為0.84%，拆分陽性數為26人次，其中25人次是HBV陽性，1人次是HIV陽性。陽性率為0.054%。2016年共拆分38次，拆分的樣本數為304人次，檢出的陽性樣本15人次。2017年共拆分26次，拆分的樣本數為208人次，檢出的陽性樣本11人次。核酸陽性標本的檢出率符合我國東部地區采供血機構的流行病學趨勢。見表2。

表2 2016～2017年無償獻血者核酸標本檢測

3 討論

做好冰凍的核酸標本的檢測應對標本從兩方面進行質量控制。第一，核酸標本凍存前應觀察標本是否存在溶血、脂血、凝塊。因為溶血的標本中含有血紅素，血紅素可通過其卟啉環與Taq酶的不可逆結合而抑制Taq酶活性，可影響PCR擴增檢測[3]。脂血的標本在加樣過程中干擾加樣針對液面的探測，容易加樣不足量。而且對熒光的屏蔽和吸收作用有干擾，影響檢測結果。凝塊的標本易在檢測加樣過程中吸到凝塊，導致加樣量不足。而且在加樣過程中會形成拖帶、拉絲現象，造成標本間的污染；而且有的加樣儀器當監測到標本有異常情況時，它會自動終止實驗，造成很大的浪費[4]。上述的標本不適合做核酸檢測，更不適合凍存后進行核酸檢測。第二，凍存后的核酸標本在檢測前的處理。于實驗開始前將核酸標本從冰箱取出，置18～25℃平衡室溫1h后顛倒混勻，隨即進行檢測。因為核酸片段在血漿中向下沉降，易吸附在試管壁、分離膠上面，故顛倒混勻這一操作步驟對檢出率影響很大。此外還應該注意，DNA樣本切忌反復凍融，若DNA樣本長期存放于-20℃環境或實驗過程中反復多次凍融，則易發生降解[5]；避免冰凍標本二次離心，會使凍融后破裂溢出的細胞液從分離膠下層進入到分離膠上層，不僅稀釋標本濃度，還會抑制核酸擴增反應。

綜上，做好冰凍核酸標本質量的控制，才能保證冰凍核酸標本檢測結果的安全可靠。對于一份核酸樣本檢測結果的判斷，還需要我們多方面因素考慮，不可大意。目前核酸項目對于采供血機構開展的時間并不長，我們還需探索發現，完善血液篩查工作。