重組人白細胞介素15蛋白的制備和鑒定方法研究①

鄭燕平，黃 晶

(1.廈門大學附屬第一醫院腫瘤中心實驗室，福建 廈門 361001； 2.廈門特寶生物工程有限公司 ，福建 廈門361001)

白細胞介素15(interleukin 15，IL-15)可經活化的成纖維細胞、表皮細胞和單核巨噬細胞等多種細胞產生，與白細胞介素2具有相似的功能和結構，可以利用其受體的β鏈和γ鏈與靶細胞結合，是一種重要的多功能細胞因子。1994年，Grabstein K. H.等在檢測猿腎上皮細胞培養上清液時發現了這種細胞因子[1]。最初這種細胞因子被發現對T細胞具有化學趨化作用而促進T 細胞的活化增殖，之后該細胞因子具有調節B細胞、自然殺傷(NK)細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、中性粒細胞和樹突狀細胞的功能也逐漸被人們發現，其通過與其它細胞因子相互作用在人體免疫調節和保護方面發揮了巨大的作用[2]。1995年這種細胞因子被正式命名為白細胞介素15。

近年來的研究表明，IL-15與許多自身免疫性疾病、變態反應性疾病及血液性疾病緊密相關[3]。IL-15廣泛參與人體免疫過程，在炎癥性疾病治療及抗腫瘤治療中具有獨特作用而備受人們關注[4,5]。

本文報道了制備和鑒定rhIL-15蛋白的方法，建立的HPLC和MALDI串聯質譜測定所制備的rhIL-15蛋白的方法能準確反映蛋白的純度和質量，為蛋白分析提供了重要的參考依據，具有較強的臨床研究價值。

1 材料和方法

1.1 材料

E.coli BL21(DE3)菌株，E. coli DH5α、pET-22b質粒購自Novagen公司。蛋白分子量標準購自Amersham 公司。DNA 分子量標準從Fermentas 公司購買。30%聚丙烯酰胺膠濃縮液購自Bio-Rad 公司。β-巰基乙醇(2-ME)，過硫酸銨，SDS，Tris，EDTA，TEMED 購自Sangon 公司。限制性內切酶，T4連接酶，異丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Thermo Fisher公司；、氨芐青霉素、咪唑、還原型谷胱甘肽(GSH) 、氧化型谷胱甘肽(GSSG) 、二硫蘇糖醇( dithiothreitol，DTT)、 LB 培養基購自廈門泰京生物技術有限公司，尿素和鹽酸胍購自廣州金華大化學試劑公司;質粒提取試劑盒，核酸回收試劑盒購自Omega公司；純化填料購自GE公司；色譜柱Agilent Bio SEC-5和Agilent ZORBAX 300SB-C18購自Agilent公司；其它試劑均為分析純。凝膠成像分析系統購自(UVP 7300) UVP 公司；超純水制備裝置(HPLC/UF) 購自PALL 公司；微型臺式高速離心機(mini spin) 購自 Eppendorf 公司；臺式高速冷凍離心機(Allegra 64R) 購自Beckman 公司；電子分析天平 (METTLER AE 240) 購自Mettler 公司；SDS-PAGE 系統購自 Bio-Rad公司；酶標儀(Model 680) 購自Bio-Rad 公司；-80℃超低溫冰箱(Scientific Bio-freezer) 購自Forma 公司；紫外/可見分光光度計(ND-1000) 購自NanoDrop 公司；多用電泳儀(Power Pac 300) 購自Bio-Rad 公司；生物反應器為GE公司產品；蛋白純化系統為GE公司產品；MALDI串聯質譜儀為ABI公司產品；高效液相色譜儀(HPLC)1200 Series為Agilent公司產品。

1.2 人IL-15 蛋白分子結構的分析

在NCBI數據庫中找到人IL-15蛋白的氨基酸序列。同時可以從網站中找到IL-15 蛋白質三維結構和四級結構。

1.3 表達載體的構建

基于人IL-15蛋白氨基酸序列，根據大腸桿菌偏好密碼子和核酸二級結構特點，我們設計了rhIL-15的cDNA序列，再在它們的5’端和3’端分別加入 BamHI和EcolI酶切位點。合成的基因片段插入pGH質粒中，使用BamHI和EcolI雙酶切，回收酶切產物并純化，使用T4連接酶將基因片段和同樣雙酶切的pET-15b質粒連接。將10μL連接產物轉化進入100μL DH5α感受態細胞，涂布于LB/Amp+平板，37℃培養過夜。挑取單菌落培養過夜，使用質粒提取試劑盒提取質粒，BamHI和EcolI雙酶切鑒定，篩選陽性克隆，對陽性克隆進行DNA測序驗證。

1.4 rhIL-15蛋白的發酵表達

經過測序驗證的質粒1μL轉化進入100μL BL21(DE3)感受態細胞，涂布于LB/Amp+平板，37℃培養過夜。挑取單菌落培養過夜，放大體積至250mL。將250mL菌液接入含2.5L LB/Amp+液體培養基的生物反應器中，37℃ 450rpm培養至對數生長早中期(OD600約為2)，加入1mM IPTG誘導6h，8000rpm離心收集菌體。

1.5 包涵體制備

菌體用6M尿素溶解，8000rpm離心收集上清，用親和填料Chelating Sepharose FF純化。用30mM Tris Cl 10mM β-ME 6M尿素pH 7.8平衡和上樣，用350mM咪唑洗脫目的蛋白。

1.6 蛋白復性

在洗脫目的蛋白中加入GSH/GSSG，10℃緩慢攪拌復性48h。把復性蛋白液用20mM TrisCl 20mM NaCl pH 7.8稀釋復性48h。(復性緩沖液A: 1mmol /L EDTA、20mmol /L Tris-HCl、0.2mmol /L GSSG、2.0mmol /L GSH、150mmol /L L-精氨酸、2.0mmol/L DTT、0.02mol/L NaCl、80mL/L甘油、1 mol /L鹽酸胍，pH7.8; 復性緩沖液B : 1mmol /L EDTA、20mmol /L Tris-HCl、0.2mmol /L GSSG、2.0mmol /L GSH、0.2mol /L L-精氨酸、2.0mmol /L DTT、0.02mol /L NaCl、80mL/L甘油、0.2g/L NaN3，pH7.8)。

1.7 復性蛋白捕獲

透析蛋白液用親和填料Chelating Sepharose FF純化。用20mM Tris Cl 20mM NaCl pH7.8平衡和上樣，用350mM咪唑洗脫目的蛋白。

1.8 蛋白純化

蛋白液用離子交換填料Q Fast Flow純化，用20mM Tris Cl 20mM NaCl pH 7.8平衡和上樣，用0.8M NaCl洗脫目的蛋白。洗脫蛋白液用凝膠過濾填料Superdex 75純化，在相應出峰位置收集目的蛋白。

1.9 蛋白電泳鑒定

電泳純度測定使用SDS-PAGE，配制15%分離膠和5%濃縮膠，20mA恒流電泳，考染檢測。

1.10 HPLC純度檢測

使用排阻色譜柱: Agilent Bio SEC-5，流動相: 0.15M 磷酸鈉0.15M NaCl pH7.0，柱溫28℃，檢測波長220nm，流速1mL/min。使用反向色譜柱: Agilent ZORBAX 300SB-C18，流動相: A 0.1% TFA/H2O B 0.1% TFA/90%ACN/H2O，柱溫28℃，檢測波長260nm，流速1ml/min。

1.11 質譜檢測

采用MALDI串聯質譜儀，點樣靶為質譜普通靶，檢驗用水為超純水(電阻率不低于18.2MΩcm，制備當天使用)，基質為芥子酸(4-羥基-3,5-二甲氧基肉桂酸)，樣品中鹽含量低于50mM，待測成分濃度高于0.01mg/mL。

1.12 生物學活性測定

將標準品和樣品稀釋至預稀釋濃度，做16個濃度梯度檢測，每個濃度做3個重復實驗，同時做陰性對照和空白對照，陰性對照為稀釋培養液+細胞，空白對照為稀釋培養液+細胞重懸培養液。取生長狀態好的CTLL-2細胞，吹打分散，1500rpm離心棄培養液，采用細胞重懸培養液重懸細胞，計數并調整適當的細胞懸液濃度，取出加入到加有標準品和樣品的96孔板中，37℃ 5% CO2培養18～24h。標準品/樣品/空白各孔加入MTT溶液，置于37℃ 5% CO2培養4～6h，再加入甲瓚裂解液吹打，酶標儀比色，檢測波長570 nm，參考波長630nm。

2 結果

2.1 重組表達載體的構建和鑒定

BamHI和EcolI雙酶切的rhIL-15基因片段回收純化，和同樣雙酶切的pET-15b質粒連接并轉化。挑取單菌落抽提質粒雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在350 bp處出現酶切片段，結果與預期一致，DNA測序也顯示序列正確。

2.2 rhIL-15合蛋白在大腸桿菌中的表達

含重組質粒pET-22b-rhIL-15的菌株經IPTG誘導表達后進行SDS-PAGE，結果顯示在分子量約16kD處出現蛋白表達條帶。

2.3 rhIL-15蛋白的純化

取2mL預培養的的培養液到200mL新鮮的LB 培養基中，37℃培養3～4h至A600為0.4～0.6時，加入濃度為0.5mmol/L 的誘導劑IPTG，37℃繼續培養4～8h，收集誘導后的菌體。重懸，超聲破碎后離心得到重組IL-15蛋白包涵體。包涵體經洗滌緩沖液洗滌后，用6mol/L鹽酸胍和6mol/L尿素溶解。我們發現，重組IL-15蛋白包涵體不溶于6mol/L的尿素而溶于6mol/L的鹽酸胍，因此我們選擇6mol/L 的鹽酸胍溶解IL-15包涵體，進一步使用親和層析、離子交換層析和凝膠過濾進行精純，我們最終獲得rhIL-15目的蛋白。

2.4 rhIL-15蛋白的純度測定

使用排阻色譜柱和反向色譜柱檢測蛋白的純度，檢測結果顯示，rhIL-15蛋白排阻柱出峰時間為11.206min，純度為98%(圖1A)，反向柱出峰時間為13.093min，純度為96%(圖1B)。

圖1 rhIL-15蛋白HPLC色譜柱檢測A 排阻柱檢測 B 反向柱檢測

2.5 rhIL-15蛋白的分子量測定

使用MALDI串聯質譜儀測定rhIL-15蛋白的分子量。rhIL-15蛋白的分子量測定結果為12768.605Da(圖2)，與理論分子量基本一致。

圖2 rhIL-15蛋白質譜的分子量分析

2.6 rhIL-15蛋白的生物學活性

采用CTLL-2/MTT比色的方法測定rhIL-15蛋白的生物學活性。通過參數回歸計算測得，蛋白的比活性為5.86×108IU/mg。

3 討論

IL-15是新近發現的一種因子，在人體多種組織和細胞中廣泛分布，在天然免疫系統中發揮著重要的作用。IL-15可誘導B細胞，T細胞和NK細胞增殖；IL-15能夠刺激，誘導LAK細胞活性，還能與IL-12協同刺激NK細胞產生IFN-γ。IL-15不僅在自身免疫系統平衡中扮演重要角色，促進各種免疫細胞的活性及增殖，還在抗病毒感染、免疫治療、腫瘤基因治療、DNA疫苗等方面表現出巨大的臨床應用潛力[6～8]。

然而IL-15在人體組織中含量甚微，難以滿足日益增加的科研與臨床需求。因此簡單高效地獲得高純度高生物學活性的rhIL-15成為十分關鍵的步驟。迄今國內外有大量文獻闡述了rhIL-15蛋白的表達和純化[9,10]，但是卻很少出現有獲得與天然的人IL-15蛋白氨基酸序列完全一致的rhIL-15蛋白的報道，本文報道的制備rhIL-15蛋白的方法，采用大腸桿菌表達系統，通過基因工程手段簡單高效地獲得rhIL-15，并且讓復性后的蛋白獲得高生物活性。眾所周知，蛋白的功能與活性取決與其正確折疊的程度。研究表明人IL-15蛋白含有2對二硫鍵[11]，rhIL-15包涵體蛋白的復性因此顯得尤其重要。我們通過摸索復性過程中的不同鹽濃度、GSH/GSSG比例、表面活性劑添加條件和稀釋條件，得到了一個合適的蛋白復性條件。最終的生物學活性分析表明，制備的rhIL-15蛋白比活性較高，為蛋白的規模化生產和進一步應用研究提供了堅實的基礎。

本實驗中利用高效液相色譜法和質譜法來檢測rhIL-15的純度和分子量。在摸索最佳條件中得出以下經驗：色譜柱類型及流動相的設置要根據待檢測樣品的理化特性，流動相的濃度要適當，如果濃度不足或過量，可能影響峰形，峰面積和分離度。 另外, 流動相pH值，柱溫，檢測波長，流速的選擇要注意結合實驗條件，遵循相應的標準，以確保檢測結果的精確性。而質譜儀測定時，樣品鹽濃度不宜過高，待測成分濃度不能過低，如有鹽濃度過高或是待測成分過低的情況可以采用超濾、使用相應萃取小柱等方法達到脫鹽和濃縮待測成分的目的。