胚源性IL-1β與人類胚胎發(fā)育及種植的關(guān)系

朱序理，趙志明，曹金鳳，杜元杰，周 亮，王 躍

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，河北 石家莊 050000)

白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)細(xì)胞因子，具有多種細(xì)胞效應(yīng)，包括促進(jìn)生長(zhǎng)、抑制生長(zhǎng)和參與細(xì)胞分化及炎癥的發(fā)生。早在1996年，一些學(xué)者通過免疫組織化學(xué)方法證明了胚胎中存在IL-1系統(tǒng)[1]，在小鼠體內(nèi)，用IL-1受體拮抗劑(IL-1 receptor antagonist,IL-1ra)阻斷IL-1 I型受體(IL-1 receptor type I, IL-1RtI)，可阻斷胚胎著床[2]，且IL-1β可觸發(fā)子宮內(nèi)膜產(chǎn)生IL-8，從而促進(jìn)內(nèi)膜造血細(xì)胞的增殖和存活[3]。本研究通過檢測(cè)卵裂期移植胚胎培養(yǎng)液中IL-1β水平，探討其是否能反映胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育及植入情況，并與胚胎形態(tài)學(xué)累積評(píng)分進(jìn)行相關(guān)性研究，以提供更客觀和準(zhǔn)確的分子標(biāo)記物輔助形態(tài)學(xué)選擇胚胎進(jìn)行移植。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2017年10—12月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射-胚胎移植(intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer,ICSI-ET)手術(shù)的新鮮周期不孕患者80例，女方年齡均≤35歲，全部為首次移植，采用單液滴單胚胎培養(yǎng)，取卵受精后第3天移植，首選形態(tài)學(xué)評(píng)估最優(yōu)質(zhì)的胚胎移植，且同時(shí)移植2枚胚胎，卵裂期培養(yǎng)液為同一批號(hào)。

1.2分組 胚胎移植4周后，確認(rèn)臨床妊娠，然后將根據(jù)每周期胚胎種植率分為A組43例、B組27例和C組10例，3組種植率分別為0%、50%和100%。

1.3儀器與耗材 培養(yǎng)箱為日本SANYO或美國(guó)Thermo CO2培養(yǎng)箱，胚胎培養(yǎng)體系為瑞典Vitrolife公司生產(chǎn)的G5系列培養(yǎng)液，人類IL-1β檢測(cè)試劑盒(Multisciences，中國(guó)杭州聯(lián)科生物公司生產(chǎn))，胚胎培養(yǎng)皿為美國(guó)B.D公司生產(chǎn)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)本收集 常規(guī)授精(17±1)h后，將受精卵洗滌后分別轉(zhuǎn)移至新配制的卵裂期培養(yǎng)液(vitrolife，G1)培養(yǎng)皿中(培養(yǎng)皿制作，每微滴定量為30 μL，覆蓋礦物油，平衡>8 h)，觀察同時(shí)記錄受精情況后，在37 ℃，6%CO2單氣培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。受精后第3天，即胚胎在G1培養(yǎng)液中培養(yǎng)(51±1) h后采用倒置顯微鏡觀察，根據(jù)胚胎實(shí)驗(yàn)室常規(guī)形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，即按細(xì)胞數(shù)、均一度、碎片等挑選2枚形態(tài)學(xué)觀察較好的胚胎進(jìn)行移植。可利用胚胎轉(zhuǎn)移后及時(shí)把培養(yǎng)皿放置常溫操作臺(tái)上，用巴斯德吸管去除液滴周圍礦物油后，液滴表面礦物油自由脫落，然后及時(shí)吸取移植胚胎的G1培養(yǎng)液滴，裝入0.2 mL EP管后混勻，離心(2 500 r/min，5 min)后取上清，編號(hào)，置于-80 ℃冷凍保存待測(cè)。空白對(duì)照組為在相同條件下未放置胚胎的G1培養(yǎng)液。

1.4.2臨床妊娠情況確認(rèn) 在胚胎移植手術(shù)后14 d，檢測(cè)血清人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG)水平，呈陽(yáng)性的患者可考慮成功植入，移植后4周通過超聲見到心血管搏動(dòng)，確認(rèn)為臨床妊娠，并根據(jù)妊娠孕囊數(shù)等確認(rèn)種植數(shù)。種植率=種植數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。

1.4.3檢測(cè)方法 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)IL-1β在胚胎培養(yǎng)液中的水平。首先在酶標(biāo)微孔板中加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及IL-1β待測(cè)樣品，然后，將生物素標(biāo)記抗體加入每孔中，室溫孵育；洗滌后，加入標(biāo)記親和素工作液進(jìn)行孵育；每孔加顯色底物避光孵育，后進(jìn)行終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定，測(cè)定各孔在450 nm最大吸收波長(zhǎng)下的OD值。最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和相應(yīng)OD值繪制線性回歸曲線，通過曲線方程計(jì)算試樣濃度。

1.4.4記錄臨床相關(guān)參數(shù) 詳細(xì)記錄夫婦雙方年齡(歲)、不孕年限(年)、體重指數(shù)、促性腺激素(gonadotropin，Gn)時(shí)間(d)、Gn總量(U)、HCG日血雌二醇(estradiol，E2)水平(ng/L)、內(nèi)膜厚度(mm)及臨床妊娠結(jié)局等資料。

1.4.5記錄胚胎實(shí)驗(yàn)室相關(guān)資料 詳細(xì)記錄獲卵數(shù)、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)卵數(shù)、雙原核(2 pro nucleus，2PN)數(shù)、2PN卵裂數(shù)、冷凍胚胎數(shù)、移植胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分等。

1.4.6移植前胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]評(píng)分規(guī)則：①胚胎細(xì)胞數(shù)為基礎(chǔ)分值，大于8記8分；②碎片分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四級(jí)，Ⅰ級(jí)(0%～5%的碎片)減1分，Ⅱ級(jí)(6%～20%的碎片)減2分，Ⅲ級(jí)(21%～50%的碎片)減3分，Ⅳ級(jí)(>50%的碎片)減4分；③細(xì)胞大小相對(duì)均勻加0.4分；④胚胎細(xì)胞形狀正常加0.4分；⑤半融合或融合胚胎加0.4分；⑥胞質(zhì)沒有異常加0.4分；⑦滿分為10分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Person檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

入組80例患者中臨床妊娠37例，臨床妊娠率為46.3%，其中單胎妊娠27例，雙胎妊娠10例。

2.13組主要相關(guān)臨床資料比較 3組女方年齡、不孕年限、體重指數(shù)、Gn時(shí)間、Gn總量、HCG日血E2水平、內(nèi)膜厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組臨床資料比較

2.23組實(shí)驗(yàn)室資料比較 3組獲卵數(shù)、ICSI卵數(shù)、2PN率、2PN卵裂率、可移植胚胎數(shù)(移植數(shù)+冷凍胚數(shù))、≥8細(xì)胞的胚胎數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組實(shí)驗(yàn)室資料比較

2.33組胚源性IL-1β水平、胚胎形態(tài)學(xué)累積評(píng)分比較 B組IL-1β水平高于A組，C組IL-1β水平高于A組和B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組移植胚胎形態(tài)學(xué)累積評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4胚胎培養(yǎng)液中內(nèi)源性IL-1β水平與胚胎形態(tài)學(xué)累積評(píng)分的關(guān)系 胚胎培養(yǎng)液中IL-1β隨胚胎形態(tài)學(xué)累積評(píng)分的升高而增高，2個(gè)變量呈正相關(guān)(r=0.587，P<0.05)。

表3 3組IL-1β水平與胚胎形態(tài)學(xué)累積評(píng)分比較

3 討 論

目前，體外受精是治療不孕癥的主要方法，通過收集卵母細(xì)胞在體外與精子受精，受精后的胚胎移植前在小滴培養(yǎng)液中培養(yǎng)，然后根據(jù)形態(tài)學(xué)評(píng)估移植2～3個(gè)最優(yōu)質(zhì)的胚胎。然而，隨著體外培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，臨床妊娠率不斷提高，多胎妊娠率也隨之增加，而多胎妊娠會(huì)增加產(chǎn)科并發(fā)癥等風(fēng)險(xiǎn)[5-6]，因此，目前許多研究在探索施行單胚胎移植的可行性及最優(yōu)方法[7-9]。2018年，專家一致認(rèn)為，通過減少胚胎移植數(shù)量，將中國(guó)體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)的多胎發(fā)生率降至20%以下[10]。因此，在保證臨床妊娠的同時(shí)，選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植，減少多胎的發(fā)生是各生殖中心面臨的挑戰(zhàn)。且在輔助生殖過程中有一個(gè)主要問題是為什么反復(fù)進(jìn)行體外受精并移植明顯質(zhì)量良好的胚胎而未發(fā)生妊娠，這一令人困惑的植入失敗是當(dāng)前研究的一個(gè)方向。常規(guī)的胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分存在主觀因素不能充分反映胚胎的發(fā)育潛能。為了進(jìn)一步鑒定胚胎發(fā)育，通過對(duì)胚胎培養(yǎng)液中胚源性物質(zhì)的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育及植入潛能將是一種很有效的方法[11-13]。

在胚胎體外培養(yǎng)和植入過程中，多種細(xì)胞因子以自分泌和旁分泌的方式被分泌，這些細(xì)胞因子與其相應(yīng)受體結(jié)合調(diào)控胚胎的增殖與分化，且參與信號(hào)傳導(dǎo)使胚胎與子宮內(nèi)膜相互作用，從而影響胚胎移植的臨床結(jié)局[14-15]。胚胎的發(fā)育及著床和腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)有很大的相似性，目前IL-1系統(tǒng)在腫瘤基礎(chǔ)研究中有了更清楚的認(rèn)識(shí)，而且在治療中得到了應(yīng)用且日漸成熟[16-18]，因此IL-1系統(tǒng)在生殖領(lǐng)域的研究可能有著重要的臨床價(jià)值。

IL-1β是IL-1系統(tǒng)中最具有生物活性的亞型之一，與生殖活動(dòng)密切相關(guān)[19]。因胚胎植入對(duì)于母體屬半同種異體移植，以往認(rèn)為主要處于免疫抑制，但近年研究發(fā)現(xiàn)成功的胚胎植入和隨后的妊娠進(jìn)展需要在促炎和抗炎信號(hào)之間實(shí)現(xiàn)更為復(fù)雜的平衡[20]。Kreines等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)妊娠和最后活產(chǎn)的婦女中，IL-1β的血清水平隨著時(shí)間的推移而升高，但對(duì)于隨后發(fā)生妊娠丟失的患者血清IL-1β水平并沒有升高；進(jìn)行胚胎移植的婦女中發(fā)現(xiàn)IL-1β水平與成功妊娠具有正相關(guān)；在妊娠試驗(yàn)陽(yáng)性患者中,如果未檢測(cè)到血清IL-1β者和后續(xù)的妊娠丟失相關(guān)。因此，證實(shí)了在體外受精周期血清IL-1β與妊娠結(jié)局有明顯相關(guān)性，并可對(duì)預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。胚胎發(fā)育和植入的成功是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的事件，涉及到母體與胚胎之間的信號(hào)對(duì)話。

近年研究表明，在體外受精輔助生殖過程中，胚胎培養(yǎng)液IL-1β水平與妊娠率呈正相關(guān)[22-24]。在這些研究中，測(cè)定胚胎培養(yǎng)液IL-1β水平時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定是主要的檢測(cè)方法；要求樣品體積至少為50 μL，這就是要有足夠的樣品體積；因此來(lái)自多個(gè)胚胎的所用培養(yǎng)液通常聚集起來(lái)用于測(cè)量細(xì)胞因子，而檢測(cè)的結(jié)果成為多個(gè)胚胎的平均值，而不是僅來(lái)自單個(gè)移植胚胎的培養(yǎng)液。因此，如何在微量的胚胎培養(yǎng)液中可靠地檢測(cè)細(xì)胞因子來(lái)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛力仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

本研究采用單液滴單胚胎培養(yǎng)，微滴定量為30 μL，檢測(cè)2枚移植胚胎的培養(yǎng)液，能較好地反映移植胚胎的IL-1β水平。入組樣本來(lái)自行ICSI患者，相對(duì)減少了顆粒細(xì)胞，精子異源性物質(zhì)的干擾。在收集過程中，培養(yǎng)皿中的礦物油首先被移除，從而微滴表面礦物油會(huì)自由下落，液滴完全暴露出來(lái)，并迅速收集，以減少礦物油對(duì)結(jié)果的影響。根據(jù)種植率分為3組，結(jié)果顯示，3組IL-1β水平有顯著差異，胚胎培養(yǎng)液中IL-1β的水平與胚胎形態(tài)學(xué)累積評(píng)分作相關(guān)分析，結(jié)果表明，IL-1β表達(dá)隨胚胎評(píng)分的升高而增高，2個(gè)變量呈正相關(guān)，這些共同提示胚胎培養(yǎng)液中胚源性IL-1β與胚胎發(fā)育及著床潛能密切相關(guān)。然而，由于酶聯(lián)免疫法檢測(cè)技術(shù)的有限性以及培養(yǎng)液微量的限制，本研究中共有5例未檢測(cè)到IL-1β，因此探索一種更有效的檢測(cè)微量IL-1β濃度的方法是一個(gè)重要的研究方向。

近年來(lái)，在胚胎體外培養(yǎng)過程中，胚胎內(nèi)源性相關(guān)的細(xì)胞因子相繼被發(fā)現(xiàn)，其分泌量能夠客觀地反映胚胎發(fā)育情況[25-27]。通過胚胎培養(yǎng)液中分泌的細(xì)胞因子的測(cè)定，可全面、客觀、準(zhǔn)確、無(wú)創(chuàng)地反映胚胎的發(fā)育植入潛能，比胚胎形態(tài)學(xué)觀察更全面、更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)胚胎移植后的臨床結(jié)局。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)只能反映某一時(shí)間的胚胎情況，而細(xì)胞因子可反映時(shí)間段的胚胎情況，更能預(yù)測(cè)胚胎走勢(shì)。因此，胚胎培養(yǎng)液中IL-1β水平能反映胚胎的發(fā)育潛能，可作為挑選優(yōu)質(zhì)胚胎的另一個(gè)重要參考指標(biāo)。測(cè)定培養(yǎng)液中IL-1β水平與形態(tài)學(xué)觀察聯(lián)合應(yīng)用，將有可能選擇出發(fā)育潛能最優(yōu)的胚胎用于移植，為廣泛實(shí)行單胚胎移植提供技術(shù)支持，保證妊娠率的同時(shí)降低多胎風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)輔助生殖臨床工作有重要的指導(dǎo)意義。但目前酶聯(lián)免疫法檢測(cè)IL-1β時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，且評(píng)估指標(biāo)的敏感度和特異度需要進(jìn)一步研究證實(shí)，因此，應(yīng)用于臨床相對(duì)于形態(tài)學(xué)評(píng)分沒有明顯優(yōu)勢(shì)，但隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，如利用芯片微流控技術(shù)測(cè)細(xì)胞因子方法探索[28]，質(zhì)譜等技術(shù)平臺(tái)的完善，將實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)胚胎培養(yǎng)液中IL-1β等細(xì)胞因子濃度，為胚胎評(píng)估提供新的參數(shù)，輔助形態(tài)學(xué)觀察。