雙載藥雙重敏感殼聚糖接枝聚合物的制備及藥物緩釋

陳 霞，牛世偉，張雪靜，朱利民

(東華大學 化學化工與生物工程學院，上海 201620)

腫瘤已經成為嚴重威脅人類健康且難以攻克的常見疾病之一，其主要療法之一的化學治療(簡稱化療)仍存在諸多問題，如化療藥物水溶性差[1-2]、耐藥性[3-4]、單一化療藥物療效不明顯、毒副作用大[5-6]等。腫瘤細胞由于代謝旺盛、生長快且增殖能力強，因此，相比正常細胞，腫瘤細胞具有溫度較高、pH值較低、乏氧等特點，可以從輸送藥物的載體著手解決化療存在的問題[7-10]。殼聚糖(chitosan，CS)因其自身對pH敏感，且具有良好的生物相容性、可降解性和對生物體無毒等諸多優點[11]，在醫藥、化工、食品、化妝品等領域受到廣泛關注。聚N-乙烯基己內酰胺(PNVCL)是一種具有溫度敏感特性的材料，其低臨界相轉變溫度(tLCST)與人體溫度相近，已被廣泛用作化療藥物的輸送載體[12]。基于CS和PNVCL的優點，采用可逆加成斷裂鏈轉移(reversible addition fragmentation chain transfer, RAFT)聚合法合成了具有溫度和pH響應的殼聚糖接枝聚N-乙烯基己內酰胺共聚物(CS-g-PNVCL)，并將其作為抗腫瘤化療藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)和齊墩果酸(oleanolic acid，OA)的藥物載體，以解決化療藥物存在的水溶性差、突釋、單一藥物療效不明顯等問題。其中，DOX是一種抗瘤譜較廣且可殺滅多種生長周期的腫瘤細胞的化療藥物，而OA不僅可以誘導人肺癌細胞[13]、人乳腺癌細胞[14]、肝癌細胞等癌細胞的凋亡，還可對腫瘤新生血管起到抑制作用[15]。

本文設計了一種具有溫度和pH雙重敏感的化療藥物載體，通過物理作用將兩種疏水性化療藥物(DOX和OA)負載于自組裝的納米顆粒疏水內核中。其原理(如圖1所示)在于：根據實體瘤的滲透與滯留增強(enhanced permeability and retention，EPR)效應，藥物載體被滯留于腫瘤部位，基于腫瘤微環境溫度較高和pH值較低的特點，藥物載體的結構發生崩塌，從而使兩種化療藥物釋放出來并作用于腫瘤部位，而在正常細胞中，藥物載體的結構幾乎不發生改變，從而降低了化療藥物對正常細胞的毒害作用，并且兩種化療藥物可以解決單一藥物療效不顯著的問題。這將為腫瘤的化療治療提供一種新的研究策略。

圖1 納米顆粒的自組裝及其釋藥機理Fig.1 Mechanism of self-assembly and drug release of nanoparticle

1 試驗部分

1.1 材料與設備

殼聚糖(脫乙酰度>90%)、醋酸、無水乙醇、氫氧化鈉、甲醇、乙醚、氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，購自國藥集團化學試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二環己基碳二亞胺(DCC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDACT)、N-乙烯基己內酰胺(NVCL)、2,2-偶氮二異丁腈(AIBN)、阿霉素(DOX)、齊墩果酸(OA)，購于阿拉丁公司(中國上海)；透析袋(截留分子量為3 500)；超純水。

AVANCE 400型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；TM-1000型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JOEL公司；BI-200SM型動態光散射儀，美國Brookhaven公司；LAMBDA 35型紫外分光光度計，美國PerkinElmer公司；Nexus-670型傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 殼聚糖的乙酰化

稱量5g CS加入250 mL質量分數為1.0%的醋酸溶液，室溫下攪拌直至CS完全溶解，然后加入250 mL無水乙醇繼續攪拌直至溶液澄清，加入0.5 mL乙酸酐溶液，用封口膜封住容器口，室溫下磁力攪拌至溶液澄清。再加入一定的NaOH溶液使CS完全析出，用紗布過濾，將過濾后固體放進冷凍干燥機中凍干。凍干后產物需烘干研磨成細小的粉末，即得到乙酰化的殼聚糖(N-CS)。

1.2.2 殼聚糖接枝RAFT聚合物制備

稱取0.292 gN-CS溶于30 mL DMF中，再加入0.37 g DDACT、0.205 g DCC和0.015 g DMAP，室溫下反應40 h(反應容器封口放在磁力攪拌器上攪拌)。然后向反應物中加入一定量冰水，倒入透析袋中透析約3 d，每3 h換一次水。將透析后的產物倒入凍干管(要求凍干管口透氣)，放入冷凍干燥機凍干，得到殼聚糖接枝RAFT聚合物(N-CS-RAFT)。

1.2.3 接枝改性乙酰化殼聚糖制備

稱取0.0468 gN-CS-RAFT并將其溶解于5 mL DMF中，在N2氛圍下磁力攪拌約4 h至完全溶解。然后加入0.0032 g AIBN和1 g NVCL，繼續在N2氣氛下60 ℃油浴、磁力攪拌1 d。再用10倍體積的冰乙醚沉淀，放入冰箱約12 h。將沉淀的上清吸棄，收集沉淀物并放入真空干燥箱1周，得到接枝改性的乙酰化殼聚糖(N-CS-g-PNVCL)。

1.2.4 CS-g-PNVCL的載藥和釋藥

將得到的N-CS-g-PNVCL加入到一定濃度的NaOH溶液中，磁力攪拌24 h去乙酰化，得到接枝改性的殼聚糖聚合物(CS-g-PNVCL)。

載藥試驗：稱量20 mg CS-g-PNVCL，將其加入到10 mL的超純水中，裝入棕色玻璃瓶磁力攪拌至充分溶解。將5 mg的DOX和5 mg OA溶于10 mL甲醇中，然后將DOX和OA的甲醇溶液逐滴滴加到棕色玻璃瓶中，封口，室溫下攪拌24 h。用透析袋室溫下透析約3 d，每3 h換一次水。將透析后的產物冷凍干燥得到載藥后的(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL粉末。

Ree=(mdt-mdf)/mdt×100%

(1)

Rdl=(mdt-mdf)/m×100%

(2)

(3)

(4)

式中：mdt為制備載藥納米顆粒所用的DOX總質量，mg；mdf為上清液中未包封的DOX質量，mg；m為載藥納米顆粒的總質量，mg；mot為制備載藥納米顆粒所用的OA總質量，mg；mof為上清液中未包封的OA質量，mg。

體外藥物釋放試驗：稱取兩份5 mg的CS-g-PNVCL/DOX@OA分別溶解于5 mL pH值為7.4和5.0的磷酸緩沖鹽(PBS)溶液中，然后將上述兩種溶液分別倒入透析袋中并置于裝有100 mL相同PBS溶液的容器中，封口。在37 ℃水浴振蕩器(振蕩頻率為100 次/min)中，按照一定時間間隔從容器中取出1 mL PBS溶液，并向容器中加入預熱的1 mL相同的PBS溶液以作補充，用以探究pH對體外藥物釋放的影響。調節水浴振蕩器的溫度為40 ℃，重復上述試驗(每組試驗重復3次)。

1.2.5 結構與性能表征

CS-g-PNVCL結構表征。取少量CS、N-CS、N-CS-RAFT、NVCL和CS-g-PNVCL，采用傅里葉紅外光譜儀進行紅外光譜(FTIR)測試，光譜范圍為600～4 000 cm-1，間隔為2 cm-1。將5 mg的N-CS-RAFT和5 mg的CS-g-PNVCL分別完全溶解于0.6 mL的DMSO-d6，采用核磁共振波譜儀進行1H-NMR測試。

(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL形貌表征。取約5 mg (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL粉末溶于10 mL超純水中，配制成質量濃度約為0.5 mg/mL的溶液，取10 μL上述溶液滴于適當大小的鋁箔紙上，低溫干燥后采用掃描電子顯微鏡(SEM)進行形貌觀察，其中噴金時間為30 s，加速電壓為10 kV。取一滴上述質量濃度為0.5 mg/mL的溶液滴到銅網上，自然晾干后通過透射電子顯微鏡(TEM)觀察材料的表觀形態。

(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL粒徑測定。稱取一定量(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL粉末充分溶解于超純水，配制成一定濃度的溶液，用孔徑為0.22 μm的濾膜進行過濾。取部分過濾后的溶液，采用動態光散射儀(DLS)進行粒徑測試。

2 試驗結果

2.1 紅外光譜分析

采用壓片法對CS、N-CS、N-CS-RAFT、NVCL、CS-g-PNVCL的紅外光譜進行分析，結果如圖2所示。

圖2 CS、N-CS、N-CS-RAFT、NVCL、CS-g-PNVCL的FTIR圖譜Fig.2 FTIR spectra of CS, N-CS, N-CS-RAFT, NVCL and CS-g-PNVCL

2.2 核磁共振氫譜分析

為進一步驗證CS-g-PNVCL是否成功制備，對N-CS-RAFT和CS-g-PNVCL的氫譜分別進行測試，結果如圖3所示。

由圖3(a)可知，化學位移2.5處為DMSO-d6的溶劑峰，CS經RAFT改性后，在化學位移約1.2處出現RAFT試劑DDACT上CH3的H峰，化學位移2.85～4.00處是CS分子中C3～C6上的質子共振峰，表明RAFT試劑已成功接枝CS。由圖3(b)可知，化學位移2.5處為DMSO-d6的溶劑峰，化學位移2.85～3.60處為CS分子中C3～C6上的質子共振峰，PNVCL特征峰在化學位移0.82～2.80處，表明CS-g-PNVCL的成功制備。

(a) N-CS-RAFT

(b) CS-g-PNVCL

2.3 (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的形貌分析

(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的SEM圖如圖4所示。由圖4可知，(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL在水相中大致呈球型，粒徑較為均勻，約為110 nm。

圖4 (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的SEM圖Fig.4 SEM image of (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL

為更好地觀察(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的形態及分布情況，采用透射電子顯微鏡(TEM)進行觀察，結果如圖5所示。由圖5可知，改性的CS自組裝后形成規則的球型，粒徑約為110 nm，分散性較好。

2.4 (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的粒徑分析

(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的粒徑分布情況如圖6所示。由圖6可知，(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的粒徑約為120 nm。由此可見，由DLS測得的粒徑比SEM和TEM測得的粒徑大一些。這是因為采用SEM和TEM進行觀察前，樣品分別需要進行干燥和烘干處理，而DLS則是測量溶液或懸浮液中顆粒的粒徑分布，故由DLS測得的粒徑比前兩者測得的粒徑大一些。

圖5 (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的TEM圖Fig.5 TEM image of (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL

圖6 (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL的粒徑分布Fig.6 Particle size distribution of (DOX/OA)@ CS-g-PNVCL

2.5 DOX@OA的體外釋放

DOX和OA在不同溫度和pH條件下的累積釋放情況如圖7所示。由圖7可知，隨著時間的推移，兩種藥物的累積釋放率曲線都呈先逐漸升高、后趨于平緩的趨勢。在72 h內，當溫度為40 ℃、pH值為5.0時，兩種化療藥物的累積釋放率最高分別達到74.2%和62.2%。由此可見，當溫度較高、pH值較低時，兩種藥物的累積釋放率都呈現較高的狀態，說明殼聚糖接枝聚合物CS-g-PNVCL上負載的DOX和OA的釋放受溫度/pH的雙重影響。這是由于CS-g-PNVCL納米顆粒對溫度和酸性環境敏感，在溫度升高、pH值降低的條件下，其結構發生一定改變，致使原始結構發生崩塌，從而促使化療藥物釋放。由此表明，CS-g-PNVCL納米顆粒是具有雙重敏感響應性的，即對溫度敏感、pH敏感。

(a) DOX

(b) OA

3 結 語

本文通過RAFT聚合法使溫敏性材料NVCL接枝于CS，并在水相中自組裝形成CS-g-PNVCL納米顆粒。FTIR和1H-NMR分析結果表明已成功合成CS-g-PNVCL共聚物；SEM和TEM觀察結果表明，(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL納米顆粒的粒徑約為110 nm；DLS的結果表明，(DOX/OA)@ CS-g-PNVCL納米顆粒的粒徑約為120 nm；載藥試驗結果表明，DOX的包封率為66.6%，載藥率為10.1%，OA的包封率為56.8%，載藥率為5.7%；體外藥物累積釋放試驗表明，殼聚糖接枝聚合物CS-g-PNVCL具有溫度、pH雙重敏感的特性，并且能根據腫瘤微環境溫度升高、pH值降低的特點達到化療藥物緩釋的作用。這將為生物醫藥領域腫瘤化療提供一種新的應用前景。