柱前衍生化-HPLC-MS/MS法測定啟脾丸中摻假蜂蜜

朱韜，何頌華，呂軼峰，羅軼

廣西壯族自治區食品藥品檢驗所（南寧 530022）

啟脾丸由人參、白術、茯苓、甘草、陳皮、山藥、蓮子、山楂、六神曲、麥芽、澤瀉11味中藥制成，具有健脾益氣、消食化積、滲濕止瀉的功效，用于脾胃虛弱、消化不良、腹脹便溏[1-2]。啟脾丸由藥材粉碎后加煉蜜制得，啟脾丸中煉蜜所占比例較大，約為55%，煉蜜的質量直接影響啟脾丸質量的優劣。

蜂蜜不僅是一種重要的天然食品，也是一種中藥。天然蜂蜜中摻入淀粉類糖漿（大米糖漿、果葡糖漿等）是蜂蜜摻假中普遍存在的一種現象[3]。根據歐盟法規，蜂蜜是純產品，添加或去除任何種類的物質均是非法的[4-5]。目前已有的蜂蜜摻假檢測技術有薄層色譜法[6]、紅外光譜法[7]、近紅外光譜法[8]、核磁共振法[9]、液質聯用法[3]等，這些技術各有特點，但是均存在一些缺陷，如操作復雜、耗時長、干擾大、靈敏度低等。試驗前期對啟脾丸中蜂蜜是否存在摻假進行了薄層色譜、蒸發光/紫外-高效液相色譜法等研究，結果均不理想。天然蜂蜜中幾乎不含五糖（DP5）以上的寡糖，而各種淀粉糖漿中均含五糖（DP5）以上的寡糖[10]。此次試驗采用1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）柱前衍生化-HPLC-MS/MS法，建立啟脾丸中寡糖測定方法，可評價啟脾丸是否使用摻假蜂蜜為原料進行生產，為提高蜂蜜摻假檢測提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 6460三重四極桿液質聯用儀，電噴霧離子源（ESI），XP205型電子天平（Mettler Toledo公司）；5010-SPE6252-AC SPE柱（Shimadzu公司）。

麥芽六糖、麥芽七糖（ELICITYL-OLIGOTECH公司）；大米糖漿、果葡糖漿、木薯糖漿、甜菜糖漿、麥芽糖漿（市售）；1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮（PMP）（天津市光復精細化工研究所）；乙腈為色譜純，水為Milli-Q制備的超純水，其它試劑均為分析純。62批啟脾丸為2018國家評價性抽驗樣品。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters CORTECS（150 mm×4.6 mm，2.7 μm），以乙腈為流動相A，水（0.1%甲酸）為流動相B，按表1比例進行洗脫；流速為0.5 mL/min，柱溫為35 ℃。

表1 HPLC測定洗脫條件

1.3 質譜條件

采用電噴霧正離子模式（ESI+），多反應離子監測（MRM）；干燥氣溫度300 ℃；霧化器壓力40 Psi；干燥氣流速5 L/min；鞘流氣溫度300 ℃；鞘流氣流速10 L/min；毛細管電壓4 000 V；噴嘴電壓500 V；選擇m/z1 483.7→511.3（PMP-麥芽七糖）和m/z1 321.5→511.3（PMP-麥芽六糖）作為檢測離子。

1.4 對照品溶液的制備

取適量麥芽六糖和麥芽七糖，精密稱定，加水制成每1 mL含0.9 μg麥芽六糖、2.8 μg麥芽七糖的混合溶液，搖勻，即得。

1.5 啟脾丸供試品溶液制備

取適量啟脾丸，剪碎，取1 g，精密稱定，置15 mL離心管中，精密加10 mL水，渦旋至全部溶散，離心（12 000 r/min）10 min，精密吸取1 mL上清液，緩緩加至活性炭固相萃取柱中，用25 mL 7%乙醇洗脫，棄去洗脫液，再用10 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，置10 mL量瓶中，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.6 衍生化試驗

分別取200 μL上述對照品溶液和供試品溶液，加入200 μ L氨水和200 μ L 0.3 mol/L PMP甲醇溶液，在70 ℃下反應30 min，反應液用氮氣吹干，加入1.0 mL高純水使其溶解；加入1.0 mL三氯甲烷，振搖提取3次，棄去有機相，得到水相，過0.22 μ m濾膜，取濾液，即得。

2 結果與討論

2.1 專屬性試驗

2.1.1 陰性對照溶液制備

依照中國藥典2015年版一部啟脾丸處方及制法加入各藥材粉末（缺煉蜜），混勻，取1 g，精密稱定，按上述方法制得。

2.1.2 煉蜜自身對照溶液的制備

取1 g煉蜜（按蜂蜜寡糖測定合格后煉得），精密稱定，按上述方法制得。

2.1.3 陽性對照溶液的制備

分別取25 mg麥芽糖漿、果葡糖漿、大米糖漿、木薯糖漿、甜菜糖漿，按上述方法制得。

2.1.4 空白試劑溶液的制備

取200 μL高純水進行衍生，按上述方法制得。

分別精密吸取1 μL衍生后溶液，注入液相色譜-質譜聯用儀，測定，即得，結果見表2。

表2 專屬性試驗結果

2.2 精密度試驗

取批號818107的供試品溶液進行衍生，依法測定，連續進樣6次。結果顯示，m/z1 321.5→511.3（PMP-麥芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麥芽七糖）峰面積RSD分別為1.03%和1.27%，說明儀器精密度良好。

2.3 穩定性試驗

取批號818107的供試品溶液進行衍生，依法測定，在24 h內不同時間進樣。結果顯示，m/z1 321.5→511.3（PMP-麥芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麥芽七糖）峰面積RSD分別為2.23%和2.40%，表明在24 h內各個被測物均穩定。

2.4 重復性試驗

取6份批號818107供試品，依法測定。結果顯示，m/z1 321.5→511.3（PMP-麥芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麥芽七糖）峰面積RSD分別為2.31%和0.39%，表明所建方法重復性良好。

2.5 檢出限

分別精密量取5和50 μL混合對照品溶液，分別加995和950 μL空白基質溶液，搖勻，即得檢出限溶液。將上述對照品溶液按擬定色譜條件分別進樣1 μL，測定。結果顯示，麥芽六糖檢出限為11.99 ng/g，麥芽七糖檢出限為2.29 ng/g。

2.6 判定濃度的考察

在自制煉蜜中，分別按質量比加入1%，5%和10%的麥芽糖漿，與各中藥材原粉混合制成摻偽樣品。結果顯示，1%麥芽糖漿摻偽樣品中，m/z1 321.5→511.3（PMP-麥芽六糖）峰面積與陰性相當，而5%麥芽糖漿摻偽樣品中，m/z1 321.5→511.3（PMP-麥芽六糖）峰面積約為陰性樣品峰面積的10倍，可有效排除陰性干擾；因此依法制成含5%大米糖漿、麥芽糖漿、果葡糖漿、木薯糖漿和甜菜糖漿的摻假樣品，分別取1 g上述樣品，依擬定方法測定，結果見表3。

表3 模擬摻假樣品和對照品

結果顯示，以不同糖漿制成的蜂蜜摻偽樣品，m/z1 321.5→511.3（PMP-麥芽六糖）和m/z1 483.7→511.3（PMP-麥芽七糖）的峰面積差異較大，因此以5%摻假糖漿平均峰面積為擬定限度的參考，分別折算出麥芽六糖濃度約為0.9 μg/mL，麥芽七糖濃度約為2.8 μg/mL。以該濃度進樣，m/z1 321.5→511.3和m/z1 483.7→511.3峰面積與各類糖漿平均峰面積基本相當，見表3。

2.7 判定方法

在以m/z1 321.5→511.3和m/z1 483.7→511.3提取的供試品離子流色譜中，應不得同時出現混合對照品溶液色譜保留時間一致的色譜峰；若同時出現，則供試品色譜中m/z1 321.5→511.3和m/z1 483.7→511.3的色譜峰面積值均應不得大于對照品溶液中相應的峰面積值。

2.8 樣品測定

按擬定方法對62批啟脾丸樣品進行檢測，結果發現62批啟脾丸均檢出麥芽六糖和麥芽七糖，其中5批啟脾丸含糖漿摻假蜂蜜。

2.9 衍生化反應原理及條件優化

糖類與PMP反應，最終生成在糖分子加上2個分子的1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮的衍生產物，反應過程如圖1所示。PMP只與還原糖反應，非還原糖不參與反應，其減少了啟脾丸中多味藥材的干擾，并且生成的衍生化產物穩定，解決了糖類物質難電離的問題。在質譜中響應弱的問題，可直接在質譜中進行檢測。根據參考文獻[11-12]，優化了衍生化反應條件，縮短了反應時間，用氨水代替NaOH溶液，無需加入鹽酸中和，即無需脫鹽便可進入質譜檢測。

圖1 1-苯基-3-甲基-5-唑啉酮與麥芽寡糖的衍生化反應

2.10 檢測離子的選擇

對混合對照品進行質譜分析，見圖2和圖3。

圖2 PMP-麥芽七糖二級質譜圖

圖3 PMP-麥芽六糖二級質譜圖

結果發現，PMP-麥芽七糖只有1個碎片離子，PMP-麥芽六糖有3個碎片離子，其中174.7和997.4響應較小，影響結果準確度，故選擇m/z1 483.7→511.3和m/z1 321.5→511.3作為檢測離子。

3 結論

在啟脾丸的樣品分析中，5批次啟脾丸涉嫌使用摻假蜂蜜進行生產，可見市場蜂蜜質量堪憂，使用摻假蜂蜜嚴重影響中成藥質量狀況。此次試驗針對糖漿摻假天然蜂蜜的普遍現象，以麥芽六糖和麥芽七糖為特征標記物，建立了柱前衍生液質聯用檢測啟脾丸中摻假蜂蜜的方法。PMP衍生試驗方法易于操控，靈敏度高，檢測結果可靠準確，為蜂蜜及含蜂蜜中藥制劑的質量控制和評價提供參考和思路。