預處理提高核桃肽得率及核桃肽乳飲料制備

逯曉丹，齊建勛，李俊，裴曉惠, ，陳永浩*，郝艷賓*

1. 北京市林業果樹科學研究院（北京 100093）；2. 北京市園林科學研究院綠化植物育種北京市重點實驗室（北京 100102）；3. 青島農業大學食品科學與工程學院（青島 266109）

核桃（Juglans regiaL.）為胡桃科胡桃屬植物，是國家重點支持的木本糧油樹種之一，2017年全國核桃種植面積超過795萬 hm2，占木本糧油樹種種植面積的50%以上，總產量417萬 t[1]。核桃仁制油的副產物——核桃粕含有50%以上的優質蛋白，通過提取蛋白并對其進行生物酶解，可以獲得具有多種活性的核桃肽，這些活性包括抗氧化活性[2-3]、降血壓活性[4-5]、降血糖活性[6-7]等。

提高具有特定活性肽的得率是酶解法制備核桃肽的研究熱點，在蛋白酶的選擇上，堿性蛋白酶[8]、中性蛋白酶[9]、復合蛋白酶[10-11]較其他蛋白酶更易獲得較高的短肽得率，通過蛋白酶的組合、優化酶解參數[12-13]，同樣可以提高短肽得率，使短肽得率68%～85%[14-15]。前期研究表明，堿性蛋白酶酶解核桃蛋白，產物的水解度和短肽得率顯著高于其它蛋白酶處理，短肽得率可提高至85.62%[15]。作為常用預處理方法的水浴加熱、超聲波處理、微波處理，應用在核桃蛋白等的制備中已見諸報道[14,16-17]，但通過預處理方法提高核桃肽得率的研究并不多。試驗以木瓜蛋白酶酶解核桃蛋白，采用不同預處理方法對核桃蛋白進行預處理，考察不同預處理方法對核桃肽得率的影響，并通過單因素和正交試驗制備感官品質和穩定性較好的核桃肽乳飲料，以期為核桃肽的產業化生產和應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核桃蛋白粉、核桃肽粉（實驗室自制）；木瓜蛋白酶（生化試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司）；β-環狀糊精、蔗糖、穩定劑等（分析純）；全脂奶粉（市售）。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型數字酸度計（上海鵬順科學儀器有限公司）；HW·SY型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表有限公司）；KDY-9830型凱氏定氮儀（北京市通潤源機電技術有限責任公司）；LXJ-IIC型低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ-400DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；DHG 9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；JA1003型精密電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；GJB8-15高壓均質機（上海東華高壓均質機廠）；YXA-LS-50S高壓式殺菌器（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；TDL-5臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 核桃蛋白粉的制備[13]

取適量的核桃粕溶于水中，浸泡打漿，用1 mol/L的NaOH調pH 8.5，在55 ℃水浴鍋中攪拌1 h，在轉速3 200 r/min下離心10 min，撇去油層，提取上清液，上清液調至pH 4.5，在轉速3 200 r/min下離心20 min，獲得蛋白沉淀，用95%乙醇洗滌2次，并加入蒸餾水，調回pH 7.0，冷凍干燥備用。

1.3.2 核桃蛋白肽粉的制備

以5 g/100 mL核桃蛋白溶液經木瓜蛋白酶在優化條件下酶解，滅酶后冷卻，調至pH 4.5，離心取上清液，調至pH 7.0，將上清液冷凍干燥后備用。

1.3.3 不同溫度加熱預處理

配制5 g/100 mL核桃蛋白溶液，分別采用不加熱、50，60，70，80，90和100 ℃預處理15 min，冷卻，調至pH 6.5，溫度至60，加入適量的木瓜蛋白酶酶解3 h，沸水浴10 min滅酶活，冷卻，調至pH 4.5，以2 000 r/min離心5 min，取上清液，調至pH 7.0，分別測定其短肽得率。

1.3.4 不同加熱時間預處理

將5 g/100 mL核桃蛋白溶液在一定溫度下加熱預處理0，15，30，45，60，75和90 min，然后冷卻，參照1.3.3的工藝參數，采用木瓜蛋白酶進行酶解，分別測定其短肽得率。

1.3.5 不同超聲時間預處理

對5 g/100 mL核桃蛋白溶液進行超聲預處理，超聲波功率400 W，處理時間分別為0，2，4，6，8，10和12 min，參照1.3.3的工藝參數，采用木瓜蛋白酶進行酶解，分別測定其短肽得率。

1.3.6 不同微波時間預處理

將5 g/100 mL的核桃蛋白溶液進行微波預處理，微波功率800 W，加熱時間分別為0，1，2，3，4，5，6和7 min，冷卻，參照1.3.3的工藝參數，采用木瓜蛋白酶進行酶解，分別測定其短肽得率。

1.3.7 核桃肽得率的測定[18]

稱取適量樣品于燒杯中，加入10 g/100 mL TCA 25 mL，混勻，靜置，定量轉移。離心后取全部上清液用濾紙過濾，移取濾液于消化管中，測定其氮元素含量。

短肽得率按式（1）計算。

式中：TCA-NSI為三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1為在10% TCA中可溶性氮，mg；N2為原料中的總氮，mg。

1.3.8 核桃肽乳飲料的制備

1.3.8.1 工藝流程

核桃肽粉→肽乳配比優化→白砂糖調味→確定穩定劑配比→均質→灌裝→殺菌→核桃肽乳飲料

1.3.8.2 核桃肽乳飲料調味

在預試驗的基礎上，選擇肽和全脂奶粉比例分別為1∶4，1∶5和1∶6，將其混合后分別溶于飲用水中，使其質量濃度達到8 g/100 mL，分別向其中添加白砂糖，使白砂糖濃度分別達到4，6和8 g/100 mL，充分攪拌，按照二因素三水平正交試驗表設置9組處理，進行感官評定打分。

1.3.8.3 感官評定方法

由10位不抽煙有感官評定經驗的人員，根據感官評定標準對產品色澤、滋味與苦味、口感、組織狀態進行評分，滿分100分。

表1 核桃肽乳感官評分標準

1.3.8.4 核桃肽乳飲料穩定性優化

選用加速離心試驗，以沉淀指數作為評價指標，具體方法為：向調配好的核桃肽乳飲料中按比例加入穩定劑，混勻后，準確移取25 mL至離心管中，在3 200 r/min下離心20 min，去除上部清液，準確稱取底部沉淀質量，利用式（2）計算沉淀指數。

沉淀指數=沉淀物質量（g）/25 mL飲料質量（g）×100% （2）

1.3.8.5 核桃肽乳飲料指標檢驗[19]

對核桃肽乳飲料進行感官檢驗、理化檢驗和微生物學檢驗等3個方面的檢驗。

2 結果與分析

2.1 加熱預處理對核桃肽得率的影響

2.1.1 加熱溫度的影響

未加熱處理的核桃蛋白由于其酶切位點都包藏于蛋白質內部，不能與蛋白酶直接接觸，使得常溫下處理的核桃蛋白酶解效果較差。適當的加熱處理可使蛋白質變性，造成蛋白分子結構松散，三級或四級結構遭到破壞，蛋白酶作用位點暴露出來，使蛋白酶作用底物濃度增大從而提高酶解速度[20]。由圖1可見，隨加熱溫度升高，短肽得率不斷提高，加熱溫度達到60℃以上時，短肽得率隨溫度升高的趨勢減緩。這可能是由于加熱溫度過高，會阻礙酶對蛋白的水解作用，隨著蛋白質結構的受熱變化，二硫鍵和疏水鍵的再生使得原松散的多肽鏈重新結合的更加緊密[20]，減少蛋白酶作用位點的暴露。

圖1 加熱溫度對核桃肽得率的影響

2.1.2 加熱時間的影響

70 ℃條件下對核桃蛋白進行加熱預處理，考察加熱時間對核桃肽得率的影響。由圖2可見，加熱30 min以內時，核桃肽得率保持在30%～40%，表明短時加熱對核桃肽得率影響不明顯。加熱45 min時，核桃肽得率達到最大值58.35%，之后隨著時間延長，核桃肽得率呈現逐級下降趨勢，這可能是由于適宜的加熱時間可以使蛋白質分子結構松散，更多蛋白酶的作用位點暴露出來，而較長時間的加熱預處理會使暴露的蛋白酶作用位點減少，從而導致核桃肽得率降低。

圖2 加熱時間對核桃肽得率的影響

2.2 超聲波處理時間對核桃肽得率的影響

由圖3可見，超聲處理1～6 min時，核桃肽得率緩慢增加，其得率均在10%以下。超聲處理7～12 min時，核桃肽得率增加速度加快，在12 min時達到最大值，為79.21%，之后隨處理時間延長，核桃肽得率呈下降趨勢。這主要是因為在超聲波處理核桃蛋白過程中，水溶液被不斷的拉伸壓縮，液體承受不了壓力時就會暫時的形成一個幾乎真空的空洞，這些空洞到達極限，崩潰時就會釋放幾萬個大氣壓的壓力，同時產生局部的高溫迫使蛋白質之間的肽腱斷裂，促使酶作用位點暴露[20]。

圖3 超聲波處理時間對核桃肽得率的影響

2.3 微波處理時間對核桃肽得率的影響

由圖4可見，微波處理1～10 min時，核桃肽得率呈上升趨勢，前7 min核桃肽得率增加較緩慢，其得率均在10%以下，在微波處理10 min時核桃肽得率達到最大值，為96.17%。之后隨著處理時間的延長，其得率呈現下降趨勢。這是由于微波電場影響了蛋白質內部分子的熱運動規律，使各個分子產生摩擦，造成分子間的水平攪拌，從而產生熱量。與此同時，蛋白質分子的二硫鍵因微波的高速震動而斷裂，使得蛋白質的結構變得疏松，非極性基團暴露，從而加快酶解速率[20]。

圖4 微波處理時間對核桃肽得率的影響

2.4 核桃肽乳飲料的配方優化

2.4.1 核桃肽乳飲料感官性狀優化

核桃肽具有特殊的苦味，與全脂奶粉混合可以改善這一感官性狀，同時通過適當添加白砂糖，可以進一步改善滋味和口感。在單因素試驗結果的基礎上，選用肽和全脂奶粉質量比、白砂糖添加量2個因素，采用二因素三水平正交試驗表進行試驗組合，對每個試驗組合進行感官評定，感官評分見表2。肽和全脂奶粉質量比1∶5，白砂糖添加量6%時感官評分最高。CMC、黃原膠以及單甘酯作為穩定劑，進行正交試驗，確定最佳穩定劑配比。

表2 感官評分表

由表3極差分析結果可知，影響核桃肽乳飲料穩定性的主次因素順序為黃原膠＞CMC＞單甘酯，即黃原膠對核桃肽乳飲料的穩定性影響最大，單甘酯對核桃肽乳飲料的穩定性影響最小，核桃肽乳飲料中穩定劑添加量分別為：CMC 0.05%，黃原膠0.05%，單甘酯0.3%。經均質、滅菌后，得到感官品質和穩定性較好的核桃肽乳飲料。

表3 核桃肽乳粉穩定劑正交試驗表

2.4.3 產品品質

2.4.3.1 感官指標

色澤均一，呈乳黃色；奶香味濃郁，有核桃的清香味；甜度適中可口；組織細膩，均勻無分層。

2.4.3.2 理化指標

可溶性固形物≥9%，蛋白質≥2.64%，總砷（以As計）≤0.2 mg/L，鉛（Pb）≤0.3 mg/L，銅（Cu）≤5.0mg/L。

2.4.3.3 微生物指標

菌落總數≤100 CFU/mL，大腸菌數≤3 MPN/100 mL，致病菌不得檢出。

3 結論

對核桃蛋白進行預處理，可有效提高酶解制備核桃肽得率。微波和超聲波預處理是提高核桃肽得率的適宜方法，經微波處理10 min后，酶解制備核桃肽的得率可達97.18%，效果最好，超聲波處理12 min后，酶解制備核桃肽的得率為77.57%。將核桃多肽與全脂奶粉以1∶5比例混合，制成濃度8 g/100 mL的溶液，向溶液中添加白砂糖6 g/100 mL、CMC 0.05%、黃原膠0.05%、單甘酯0.3%，經均質、滅菌可以獲得感官品質和穩定性良好的核桃肽乳飲料。