地膽草提取物清除亞硝酸鹽的作用

范瓊，趙敏，王曉剛，鄧愛妮，葉海輝

1. 中國熱帶農業科學院分析測試中心（海口 571101）；2. 海南省熱帶果蔬產品質量安全重點實驗室（海口 571101）

食物中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量與人類健康有著密切的關系，硝酸鹽自身對人體危害不大，常作為食品添加劑被廣泛用于食品加工中，但它在人或動物體內容易被還原成亞硝酸鹽，在胃液中亞硝酸鹽容易能與次級胺合成N-亞硝胺[1]。N-亞硝胺具有很強的致癌性，其中有些化合物在一次劑量后即可誘發癌癥，有些甚至能穿過胎盤屏障給后代誘發腫瘤[2]。綠葉蔬菜也是膳食硝酸鹽的主要來源，可以通過硝化細菌在胃中還原成亞硝酸鹽[3]。中國的養生文化素來講求藥食同源，將中草藥作為膳食食材與蔬菜肉類一起烹飪，既可以保持蔬菜肉類的新鮮度和口感，又可以提高食品營養安全，因此尋找安全有效清除亞硝酸鹽或抑制亞硝化反應的中草藥已成為食品應用領域的研究熱點之一[4]。目前已有研究表明某些藥食同源的中草藥如金銀花、仙鶴草、何首烏、冰糖草、紅冬蛇菰等[5-9]均具有清除亞硝酸鹽、抑制亞硝胺合成的作用。

地膽草（Elephantopus scaberLinn.）為菊科地膽草的帶根全草，又名苦地膽、土公英、磨地膽等[10]。地膽草有涼血、清熱、解毒、利濕之功效，自古以來作為傳統藥物在國內外民間被廣泛應用。現代藥理學研究證實，地膽草主要含有萜類、黃酮類、甾體類等化合物[11]，具有保肝、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗高血壓、抑制黑色素等[12-13]生物活性，但是目前鮮見有地膽草清除亞硝酸鹽相關研究報道。此次試驗以地膽草為研究對象，對其清除亞硝酸鹽效果進行了初步探究，并通過正交試驗確定了地膽草提取物清除亞硝酸鹽的最佳條件，為地膽草進一步開發利用提供科學依據和數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地膽草全草，購于海南省儋州市紅旗市場，經鑒定為地膽草全草。將地膽草全草洗凈晾干，置75 ℃烘箱內烘干，研磨粉碎后過孔徑0.150 mm篩，存于干燥陰涼處，備用。

鹽酸萘乙二胺、對氨基苯磺酸、亞硝酸鈉均為國產分析純。

植物粉碎機；SHZ-B水浴恒溫振蕩器（常州諾基儀器有限公司）；FD53熱風循環式烘箱（德國Binder賓得公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；AE200型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；UV-3900紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 亞硝酸鹽清除率的測定

吸取2份2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液，分別置于25 mL比色管中，其中1份加入10 mL地膽草提取液，另1份加入10 mL提取劑，2份搖勻反應10 min后，均加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸，搖勻反應4 min后，加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，定容至25 mL后搖勻，在室溫下反應15 min，以4 000 r/min離心5 min，在最大吸收波長538 nm處測定吸光度，并以式（1）計算清除率。

式中：A0為提取溶劑和亞硝酸鈉反應的吸光度；Ai為地膽草提取液與亞硝酸鈉反應的吸光度；Aj為對照試驗反應的吸光度。

1.2.2 提取工藝對亞硝酸鹽清除率的影響

1.2.2.1 浸提溶劑對亞硝酸鹽清除率的影響

準確稱取4份地膽草粉末，每份10 g，分別加入200 mL蒸餾水、80%甲醇、80%乙醇、80%丙酮提取劑，室溫振蕩24 h，取出后離心過濾，所得濾液用提取溶劑定容到200 mL，即為地膽草不同提取液。按照1.2.1試驗方法測其對亞硝酸鹽的清除效果。

1.2.2.2 料液比對亞硝酸鹽清除率的影響

準確稱取4份地膽草粉末，每份10 g，以1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）比例量取蒸餾水，在室溫中振蕩24 h，取出后離心過濾，所得濾液用蒸餾水分別定容至100，150，200和250 mL，所得濾液為不同料液比的地膽草水提取液。按照1.2.1試驗方法測其對亞硝酸鹽的清除效果。

1.2.3 反應條件對亞硝酸鹽清除率的影響

1.2.3.1 提取液用量對亞硝酸鹽清除率的影響

分別吸取1，2，5，7和10 mL的地膽草水提取液，其余步驟按照1.2.1試驗方法測其對亞硝酸鹽的清除效果。

1.2.3.2 反應溫度對亞硝酸鹽清除率的影響

按照1.2.1的試驗方法，分別在30，40，60，80和100 ℃下反應15 min，在最大吸收波長538 nm處測定其吸光度，測定不同溫度下的亞硝酸鹽清除率。

1.2.3.3 反應時間對亞硝酸鹽清除率的影響

按照1.2.1的試驗方法，在室溫下分別反應15，30，45，60和120 min，在最大吸收波長538 nm處測定其吸光度，測定不同反應時間下亞硝鹽清除率。

1.2.3.4 反應pH對亞硝酸鹽清除率的影響

按照1.2.1的試驗方法，在pH分別為1.2，3和7下室溫反應15 min，在最大吸收波長538 nm處測定其吸光度，測定不同反應pH下亞硝鹽清除率。

1.2.4 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，用L9(33)正交試驗對料液比、反應溫度、pH進行試驗，研究其對地膽草清除亞硝酸鹽效果的影響，并明確其影響清除效果的主次，確定最佳反應條件。其因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5 數據分析

所有試驗數據以3次試驗的x±s表示。數據用Excel 2007軟件進行單因素方差分析，p＜0.05表示顯著性差異，p＜0.01表示極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑對亞硝酸鹽清除率的影響

由表2可知，不同溶劑提取的地膽草提取液對亞硝酸鹽的清除率不同，差異性極顯著：水提取液＞80%丙酮提取液＞80%甲醇提取液＞80%乙醇提取液。地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率達到53.95%，比地膽草有機提取液清除亞硝酸鹽率高，差異性極顯著。這表明地膽草清除亞硝酸鹽的有效成分更易溶解于水提取劑中。

表2 不同溶劑對亞硝酸鹽清除率的影響

2.2 料液比對亞硝酸鹽清除率的影響

從圖1中可以看出，隨著料液比的增加，地膽草80%乙醇提取液、80%丙酮提取液、水提取液的亞硝酸鹽清除率也相應增加。當料液比為1∶10（g/mL）時，地膽草80%乙醇提取液、80%丙酮提取液和水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為19.82%，28.00%和53.95%。料液比越高，提取液中含有的地膽草抗氧化成分越高，其清除亞硝酸鹽能力越強，但是成本相應越高。

圖1 地膽草提取液料液比對亞硝酸鹽清除率的影響

2.3 地膽草水提取液用量對亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖2中可以看出，隨著水提取液用量的增加，其對亞硝酸鹽的清除率增強。當水提取液用量為10 mL時，地膽草對亞硝酸鹽清除率為52.90%。

圖2 地膽草水提取液用量對亞硝酸鹽清除率的影響

2.4 亞硝酸鹽用量對亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖3中可以看出，亞硝酸鹽用量越大，地膽草水提取液對亞硝酸鹽的清除效果越低。當亞硝酸鹽用量為1 mL時，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率為60.07%。

圖3 亞硝酸鹽用量對亞硝酸鹽清除率的影響

2.5 反應時間對亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖4中可以看出，當反應時間為40 min時，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率最高，為53.48%；超過40 min，地膽草對亞硝酸鹽清除效果逐漸達到平衡。

2.6 反應溫度對亞硝酸鹽清除效果的影響

從圖5中可以看出，在30～100 ℃時，隨著反應溫度的增加，水提取液的亞硝酸鹽清除率小幅提升，當反應溫度達到60 ℃時，水提取液的亞硝酸鹽清除率達到54.62%。溫度升高，會促進分子運動速度，從而加快地膽草水提取物與亞硝酸鹽反應速率。但是溫度過高，會破壞地膽草水提取液中的有效成分，同時部分亞硝酸鹽發生氧化作用，從而使亞硝酸鹽清除率有所下降[14]。

圖5 反應溫度對地膽草水提取液亞硝酸鹽清除率的影響

2.7 反應介質pH對亞硝酸鹽清除率的影響

從圖6中可以看出，當pH為1.2，3和7時，不同地膽草提取液的亞硝酸鹽清除效果不同。當pH為1.2時，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為29.0%，35.4%和54.7%；當pH為3時，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為19.8%，28.0%和53.9%；當pH為7時，80%乙醇、80%丙酮、水提取液的亞硝酸鹽清除率分別為10.4%，18.8%和29.2%。結果顯示，反應pH越低，地膽草提取液的亞硝酸鹽清除率效果越明顯，這是因為在酸性條件下，亞硝酸鹽易轉化為亞硝酸，進而轉化為N2O3，地膽草提取物可將N2O3轉化為NO，因此阻斷了亞硝胺的行程[15]。在相同的pH條件下，水提取液的亞硝鹽清除效果比其他2種有機溶劑提取液效果更好，這與表1的結果一致。

2.8 最佳反應條件的確定

從表3中可以得出，最佳方案是A1B2C1，即料液比1∶10（g/mL），提取溫度60 ℃，pH 1.2。在此條件下，對地膽草水提取液對亞硝酸鹽清除效果為61.10%。其中因素C（pH）是影響亞硝酸鹽清除效果的最重要因素，因素A（料液比）次之，最后是因素B（反應溫度）。

表3 地膽草清除亞硝酸鹽效果的正交試驗表

3 討論與結論

近年來關于地膽草生物活性的研究逐漸增多，溫先敏等[16]研究表明地膽草具有較強的抗炎鎮痛效果；梁僑麗等[17]研究發現從地膽草中分離出的兩種倍半萜內酯化合物對人體肝癌細胞、宮頸癌細胞和結腸腺癌的生長具有抑制作用；Su等[18]研究表明地膽草提取物可以誘導并激發鼻咽癌細胞中的細胞周期阻滯與細胞凋亡；Wiwat等[19]研究發現地膽草水提取物具有抗艾滋病病毒逆轉錄酶活性作用；范瓊等[13]研究發現地膽草具有降低高血壓、抗黑色素及抗氧化等生理活性，這些生理活性與地膽草含有倍半萜內酯類、多酚類、黃酮類等活性成分息息相關。

此次試驗測定了地膽草對亞硝酸鹽的清除能力，并通過對地膽草不同的提取工藝和反應條件優化對亞硝酸鹽的清除能力進行研究。試驗結果表明，地膽草不同溶劑對亞硝酸鹽的清除效果大小依次為水提取液、80%甲醇提取液、80%乙醇提取液、80%丙酮提取液；地膽草水提取液對亞硝酸鹽清除率為53.95%，差異性極顯著。在單一因素試驗中，隨著料液比和地膽草提取液用量增加，地膽草清除亞硝酸鹽效果均會增強，當料液比1∶10（g/mL）時，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率為53.95%；當地膽草水提取液用量為10 mL時，亞硝酸鹽清除率為52.90%；而在反應溫度30～100 ℃條件中，反應溫度為60 ℃時地膽草水提取物的亞硝酸鹽清除率為最高，為54.62%，之后隨著溫度的升高，地膽草水提取物的亞硝酸鹽清除率降低，差異性極顯著。如果投入生產，料液比過高、提高地膽草用量以及反應溫度均會增加前處理成本，因此選擇一個最佳提取和反應方案非常重要。正交試驗表明，在料液比1∶10（g/mL）、反應溫度60 ℃、pH 1.2的條件下，地膽草水提取液的亞硝酸鹽清除率最高，可達到61.10%。且pH是影響地膽草清除亞硝鹽效果的最重要因素。人體胃酸pH在1.2～3左右，這表明地膽草在人體胃中可以發揮更佳清除亞硝酸鹽效果。比較于其他中草藥，例如紅冬蛇菰石油醚提取物的亞硝酸鹽清除率為59.35%[9]，蒲公英的亞硝酸鹽清除率為49.47%，珍珠菜的亞硝酸鹽清除率為20.40%[20]，說明地膽草具有較好的消除亞硝酸鹽效果，不僅在藥品開發，而且可以在食品加工上有很好的應用前景。