超聲波輔助提取白蕓豆皂苷的工藝

石瑞，王朝轉，宿婧，史曉晶，王明華

忻州師范學院生物系（忻州 034000）

蕓豆是一種可以食用的豆科植物，生物學名為菜豆，又稱二季豆或四季豆，屬豆科菜豆屬的小宗雜糧作物。蕓豆具有豐富的營養和很高的藥用價值，如含有豐富的蛋白質、脂肪、膳食纖維、維生素A、維生素C、鈣、鈉、鐵等[2]。蕓豆含有的花色苷、皂苷等成分，能提高人體的非特異性免疫，增強抗病能力，激活T淋巴細胞和抑制腫瘤細胞等作用。蕓豆中的皂苷類物質能促進脂肪的代謝，是減肥者理想的食品之一[2]。有研究表明，皂苷類物質還具有多種藥理作用，如抗真菌、抗炎、抗氧化、防止心血管疾病、降血糖和免疫調節、降低膽固醇等[1]。

提取皂苷的方法有超聲波提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法和回流提取法等[3]。試驗采用超聲波提取法，使用超聲波輔助提取皂苷既節省了提取溶劑和減少提取時間，同時有利于對有效成分的保護。試驗以乙醇體積分數、超聲時間、超聲功率和料液比為研究因素，探討白蕓豆皂苷的最佳提取工藝，以期為白蕓豆皂苷的開發與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

白蕓豆（山西省忻州市）。

無水乙醇；高氯酸；香草醛；冰乙酸；齊墩果酸標準品；甲醇；試驗試劑均為分析純，試驗用水為一次蒸餾水。

1.2 主要設備與儀器

密封型手提式粉碎機（DXF-0AC，浙江紅景天工貿有限公司）；電熱鼓風干燥箱（KHD-40A，中新醫療儀器有限公司）；型數控超聲波清洗器（KQ4800TV，深圳市光點超聲波設備有限公司）；低速離心機（LC-4016，北京卓山電子科技有限公司）；二列八孔智能水浴鍋（HK-27，常州金壇良友儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（UV-1800，浙江塞德儀器設備有限公司）；紫外可見光譜儀（島津UV2550，島津技邇商貿有限公司）；電子天平（JA203，深圳市科衡儀器電子有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 白蕓豆皂苷提取工藝路線

白蕓豆粉→稱量→超聲浸提→離心→取樣液→測定吸光度→計算皂苷含量

1.3.2 白蕓豆皂苷提取率的計算

取各0.1 mL上清液，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，搖勻，在60 ℃恒溫水浴鍋顯色10 min，取出后置于冰水中冷卻至室溫，加5 mL冰醋酸搖勻，靜置15 min，以提取液空白作為對照，在478 nm處測定其吸光度。對應齊墩果酸標準曲線，計算得到白蕓豆皂苷含量[4]。

式中：X為蕓豆皂苷總含量，mg/g；V為樣品定容的體積，mL；C為提取液質量濃度，mg/mL；M為白蕓豆粉末質量，g。

1.3.3 超聲時間的選擇

準確稱取白蕓豆粉1 g，固定料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數70%、功率60 W，分別以超聲時間10，20，30，40，50和60 min進行試驗，進行超聲提取，在轉速4 000 r/min離心機中離心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白為對照，在478 nm處測定吸光度，探討超聲時間對白蕓豆皂苷提取率的影響。

1.3.4 料液比的選擇

準確稱取白蕓豆粉1 g，超聲功率60 W、乙醇體積分數70%、超聲時間30 min，分別以料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30（g/mL）進行試驗，進行超聲提取，在轉速4 000 r/min離心機中離心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白為對照，在478 nm處測定吸光度，探討料液比對白蕓豆皂苷提取率的影響。

1.3.5 超聲功率的選擇

準確稱取白蕓豆粉1 g，固定料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分數70%、超聲時間30 min，分別以超聲功率60，75，90，105，120和135 W進行試驗，進行超聲提取，在轉速4 000 r/min的離心機中離心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白為對照，在478 nm處測定吸光度，探討超聲功率對白蕓豆皂苷提取率的影響。

1.3.6 乙醇體積分數的選擇

準確稱取白蕓豆粉1 g，固定料液比1∶20（g/mL）、超聲時間30 min、功率60 W，分別以乙醇體積分數40%，50%，60%，70%，80%和90%進行試驗，進行超聲提取，在轉速4 000 r/min離心機中離心10 min，取上清液定容到50 mL。取上清液0.1 mL按照1.3.2方法，以提取液空白為對照，在478 nm處測定吸光度，探討乙醇體積分數對白蕓豆皂苷提取率的影響。

1.3.7 正交試驗的設計

根據單因素試驗結果采用L9(34)正交設計對白蕓豆皂苷提取條件進行優化，設定正交試驗因素水平表，見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.8 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 17.0對試驗數據進行分析，用Origin軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

由圖1可知，齊墩果酸標準曲線的回歸方程為y=0.000 4x+0.005 6，R2=0.985 1，標準曲線的相關性良好。根據提取液的上清液吸光度，對應齊墩果酸標準曲線，可以計算出提取液中的白蕓豆皂苷含量，進一步可計算出白蕓豆皂苷提取率。

圖1 齊墩果酸標準曲線

2.2 超聲時間對白蕓豆皂苷提取率的影響

由圖2可知，超聲時間10～30 min時，白蕓豆的皂苷提取率隨提取時間的增加而呈現上升趨勢，超聲時間30 min時，白蕓豆的皂苷提取率達到最大值，達5.96%，之后皂苷提取率開始下降。分析原因可能是適當的超聲時間會有利于皂苷分子的溶出，而超聲時間太長會造成蛋白質構型破壞，使得白蕓豆中的大豆蛋白凝集沉淀，從而影響大豆皂苷的溶出，因此，白蕓豆皂苷最佳超聲時間30 min最好。

圖2 不同超聲時間對白蕓豆皂苷提取率的影響

2.3 料液比影響因子

由圖3可知，料液比1∶10～1∶20（g/mL）時，白蕓豆皂苷提取率和料液比呈正相關，料液比1∶20（g/mL）時，白蕓豆皂苷提取率達到最大值，達6.68%。而溶劑用量再增加時提取率降低，說明過高和過低的料液比并不能使皂苷提取率明顯提高，因此，白蕓豆料液比應選擇1∶20（g/mL）比較適宜。

圖3 料液比對白蕓豆皂苷提取率的影響

2.4 超聲功率影響因子

由圖4可知，超聲功率75 W時，白蕓豆皂苷提取率都達到最大值，達到6.48%，隨后皂苷提取率反而開始下降，且皂苷的提取率與超聲功率的上升呈負相關。分析原因可能是太低超聲功率不利于液體介質間產生足夠大的振幅，而超聲功率太高又會導致液體介質間產生猛烈的撞擊作用，微粒間發生劇烈的相互作用會使液體的溫度驟然升高，造成皂苷結構的破壞，因此，白蕓豆皂苷的超聲功率選擇在75 W時最適宜。

圖4 超聲功率對白蕓豆皂苷提取率的影響

2.5 乙醇體積分數影響因子

由圖5可知，乙醇體積分數從40%增加到70%過程中，白蕓豆的皂苷提取率與乙醇的濃度呈現正相關，且乙醇體積分數為70%時，白蕓豆皂苷提取率最大，達5.64%，隨著乙醇體積分數繼續加大，白蕓豆皂苷提取率與乙醇體積分數變化量呈負相關。分析原因可能是皂苷中的苷元親水性很弱低，乙醇體積分數有利于親水性物質如蛋白質、糖類等雜質的溶解，從而對皂苷的提取率造成影響，而高乙醇體積分數又會增加蛋白質和糖類等雜質溶出，因此，白蕓豆皂苷提取的乙醇體積分數為應選擇70%為宜。

2.6 正交試驗優化白蕓豆皂苷提取條件

進行L9(34)正交優化試驗，得出最佳提取工藝，試驗結果見表2。

由表2極差分析結果可知，影響白蕓豆皂苷得率的各因素主次關系為：A（超聲時間）＞C（超聲功率）＞D（乙醇體積分數）＞B（料液比）。白蕓豆皂苷提取的最佳工藝組合為A2B2C2D2，即超聲時間40 min、料液比1∶20（g/mL）、超聲功率75 W、乙醇體積分數70%。在該條件下，進行驗證試驗，每1 g白蕓豆粉中皂苷的提取率達6.764%。相比于其他正交試驗組的結果要好。因此，此工藝條件對白蕓豆皂苷提取具有較好的穩固性和可行性。

圖5 乙醇體積分數對蕓豆皂苷提取率的影響

表2 正交試驗結果分析

3 結論與討論

以忻州雜糧白蕓豆為原料，乙醇為提取劑，超聲波提取儀輔助提取白蕓豆中的皂苷，進行單因素試驗和正交優化試驗，探討不同因素對白蕓豆皂苷提取工藝的影響。結果表明，影響白蕓豆皂苷得率的各因素主次關系為：A（超聲時間）＞C（超聲功率）＞D（乙醇體積分數）＞B（料液比）。白蕓豆皂苷提取的最佳工藝組合為A2B2C2D2，即超聲時間40 min、料液比1∶20（g/mL）、超聲功率75 W、乙醇體積分數70%。在最優條件下，每1 g白蕓豆粉中皂苷的提取率達6.764%。因此，方法在一定程度上優化白蕓豆皂苷的提取工藝，具有方法簡單，生產周期短，材料經濟等特點，可作為白蕓豆皂苷提取的理論參考。