辣木葉提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制

鐘英英，周佳明，葉美鳳，何湘惠，邢韓寒，葉云

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）

辣木為辣木科辣木屬多年生熱帶喬木，因其有辛辣味的根而得名[1]。辣木作為一種新開(kāi)發(fā)利用的食品，其具有生長(zhǎng)迅速、營(yíng)養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景[2-3]。近年來(lái)，對(duì)辣木葉的綜合利用主要表現(xiàn)在辣木有效成分的提取及保健食品開(kāi)發(fā)。

黃嘌呤氧化酶能催化氧化黃嘌呤和次黃嘌呤生成尿酸[4]，當(dāng)體內(nèi)尿酸濃度過(guò)高可能會(huì)引起高尿酸血癥進(jìn)而引發(fā)痛風(fēng)[5]。黃嘌呤氧化酶抑制劑作為治療痛風(fēng)的最主要藥物具有良好的發(fā)展前景，它可以通過(guò)降低黃嘌呤氧化酶的活性，抑制尿酸的生成，進(jìn)而減少尿酸在體內(nèi)的含量而達(dá)到治療痛風(fēng)的目的[6-7]。然而，市面上常用的黃嘌呤氧化酶抑制劑通常毒副作用較多，會(huì)引發(fā)藥疹、發(fā)熱、頭痛、肝臟損害及過(guò)敏等副反應(yīng)[8-9]，嚴(yán)重威脅人體健康。因此，開(kāi)發(fā)天然無(wú)毒副作用安全的降尿酸藥物，成為重要研究方向。試驗(yàn)通過(guò)探討辣木葉提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用，為研究安全新型的降尿酸藥物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

將辣木葉洗凈、烘干、粉碎后過(guò)篩，置于陰涼干燥處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

別嘌呤醇、黃嘌呤氧化酶（上海源葉生物科技有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 辣木葉提取單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱量1.000 g辣木葉細(xì)粉，于超聲波-微波協(xié)同萃取儀進(jìn)行提取，固定超聲波、微波功率分別為50 W、200 W，改變時(shí)間（700，800，900，1 000和1 100 s）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（40%，50%，60%，70%和80%）、提取溫度（40，50，60，70和80 ℃）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL））4個(gè)因素的不同水平進(jìn)行萃取。將所得提取液離心、濃縮得浸膏。配成40 mg/mL提取液，測(cè)定其抑制率。

1.2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以黃嘌呤氧化酶的抑制率為指標(biāo)，參考劉靜波等[10]試驗(yàn)，設(shè)計(jì)L9(34)正交表，確定最佳提取條件。開(kāi)展驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，求RSD值。

1.2.3 黃嘌呤氧化酶活性抑制試驗(yàn)

按照表1的順序加入藥品混合均勻，25 ℃水浴反應(yīng)1 min，終止反應(yīng)，290 nm測(cè)吸光度。提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率（I）為：OD1～OD4分別為試驗(yàn)1～4在290 nm測(cè)得的吸光度（第1個(gè)試管測(cè)得的OD值以第3個(gè)試管為空白對(duì)照測(cè)得；第2個(gè)試管的OD值以第4管為空白對(duì)照測(cè)得）。

表1 黃嘌呤氧化酶活性抑制試驗(yàn)反應(yīng)體系

1.2.4 抑制常數(shù)的測(cè)定

在5 mL反應(yīng)體系中，黃嘌呤氧化酶酶液濃度固定為0.05 U/mL，底物黃嘌呤的濃度分別為0.3和0.6 mmol/L，測(cè)定不同濃度辣木葉提取物酶解的反應(yīng)初速度。以提取物濃度作橫坐標(biāo)，反應(yīng)初速度的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)，作Dixon圖，求抑制常數(shù)Ki值。

1.2.5 抑制類型的測(cè)定

在5 mL反應(yīng)體系中，黃嘌呤氧化酶酶液濃度固定為0.05 U/mL，底物濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mmol/L。測(cè)定辣木葉提取物質(zhì)量濃度為0和5 mg/mL開(kāi)始酶解的反應(yīng)初速度。以1/[S]為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)，作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，推斷出抑制類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)提取所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%～70%之間時(shí)，抑制率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而逐漸變大；乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，抑制率達(dá)到最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)70%后，抑制率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大呈下降趨勢(shì)。原因可能是乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)較低，不能把辣木葉中的有效成分完全提取出來(lái)，而乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)過(guò)高可能導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，從而妨礙乙醇向植物細(xì)胞滲透，影響有效成分的浸出，故抑制率下降。故選定最適乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為60%～80%。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.2 不同提取時(shí)間所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖2可知，抑制率隨提取時(shí)間呈現(xiàn)先上升再下降趨勢(shì)，提取時(shí)間900 s時(shí)抑制率達(dá)到最大。原因可能是提取時(shí)間過(guò)短，辣木葉中的有效成分未被完全提出來(lái)，從而導(dǎo)致抑制率隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。提取時(shí)間900 s時(shí)，辣木葉中有效成分基本被完全提取，故抑制率達(dá)到最大。繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取出的有效抑制活性成分被破壞或被氧化分解，使得抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 不同提取時(shí)間提取所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.3 不同料液比提取所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖3可知，料液比在1∶10～1∶40（g/mL）時(shí)，抑制率隨料液比增大而增大；料液比1∶40（g/mL）時(shí)，抑制率達(dá)到最大；料液比超過(guò)1∶40（g/mL）時(shí)，抑制率隨料液比增大逐漸下降。原因可能是料液比小于1∶40（g/mL）時(shí)，料液比及濃度梯度越大，有效成分溶出越多，抑制作用逐漸增強(qiáng)；當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，有效成分可能被完全提出，抑制率達(dá)到最大，已達(dá)到平衡；達(dá)到平衡之后，再增大料液比，浸出物變化不明顯。

圖3 不同料液比提取所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.4 不同溫度提取所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

由圖4可知，提取溫度在40～70 ℃之間，溫度越高，抑制率越高；溫度達(dá)到70 ℃時(shí)，抑制率達(dá)到最大；在70～80 ℃范圍內(nèi)，抑制率隨提取溫度升高呈下降趨勢(shì)。原因可能是溫度在40～70 ℃范圍內(nèi)，溫度升高加快乙醇的冷凝回流，導(dǎo)致辣木葉有效成分的提取速率增加，提取效果明顯提高，故抑制率逐漸上升；提取溫度70 ℃時(shí)，有效成分可能被完全提取出，抑制率達(dá)到最大；提取溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，提取物中有效活性成分被高溫氧化，導(dǎo)致提取效率降低，從而導(dǎo)致抑制率下降。

圖4 不同溫度提取所得提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響

2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素的結(jié)果，設(shè)計(jì)L9(34)正交表[11-12]，以提取液對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)如表2，結(jié)果如表3所示。

表2 正交設(shè)計(jì)因素水平表

表3 辣木葉提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制影響正交表

由表3可知，各因素的主次順序依次為B＞C＞A＞D，且最優(yōu)的組合為B2C2A2D2，在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，平均抑制率為79.81%，RSD值為0.66%。

2.6 辣木葉提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的影響

2.6.1 抑制常數(shù)的測(cè)定

Ki值是表征辣木葉提取物對(duì)酶促反應(yīng)抑制效率的重要參數(shù)，該值越小，表明辣木葉提取物對(duì)該酶促反應(yīng)抑制效果好。由圖5可知，在底物濃度0.3 mmol/L和底物濃度0.6 mmol/L，改變提取物濃度，得出其對(duì)反應(yīng)速度的影響曲線交點(diǎn)橫坐標(biāo)的絕對(duì)值為6.76，所以辣木葉乙醇提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制常數(shù)Ki=6.76 mg/mL。

圖5 辣木葉提取物的黃嘌呤氧化酶反應(yīng)Dixon

2.6.2 抑制類型的測(cè)定

存在有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑時(shí)，Km’會(huì)增大，Vmax’不變。從圖6可以看出，辣木葉提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征。競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用是最為常見(jiàn)的一種抑制類型，往往是酶的底物類似物或者是反應(yīng)產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與酶的結(jié)合部位與底物與酶的結(jié)合部位相同。

通過(guò)和底物黃嘌呤競(jìng)爭(zhēng)黃嘌呤氧化酶的結(jié)合部位，影響它們的正常結(jié)合，從而抑制黃嘌呤氧化酶的活性，進(jìn)而減少尿酸的生成。提取物濃度變大時(shí)，其抑制率也將變大。

圖6 加辣木葉提取物后黃嘌呤氧化酶的Lineweaver-Burk圖

3 結(jié)論

采用超聲波輔助提取獲得辣木葉的乙醇提取物，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，即最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間900 s、提取溫度70 ℃、料液比1∶40（g/mL）。在此條件下，辣木葉提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶活力的抑制率為79.81%。

辣木葉提取物對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，抑制常數(shù)Ki=6.76 mg/mL，半抑制濃度IC50=10.55 mg/mL。