反向離子對高效液相色譜-電感耦合等離子質譜聯用分析富硒食品中硒的形態

黃韜睿，王鑫，王小平

(1.四川旅游學院 烹飪學院，成都 610100；2.四川省食品藥品檢驗檢測院，成都 610097)

硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化、抗腫瘤、提高機體免疫力等顯著的生理功能，所以維持機體中適量的硒水平能預防多種疾病，如癌癥、克山病、大骨節病等[1]。然而，從世界衛生組織公布的數據來看，全球存在普遍缺硒的問題，40多個國家和地區處于低硒或缺硒的狀態[2]。目前人們可通過多種途徑補充硒元素，如藥物、硒營養強化劑、膳食補硒等，其中通過食物補硒是最便捷的方法，也是最值得推崇的方法，因此諸如富硒大米、富硒小麥、富硒酵母、富硒平菇、富硒靈芝、富硒土豆、富硒豬肉、富硒酸奶等富硒食品的研究和開發成為人們關注的熱點[3]。硒元素毒性與營養的閾值范圍極窄，國際學術組織聯合會(FAO/WHO/IAEA)建議成年男女膳食硒適宜需要量分別為40 μg/d和30 μg/d[4]。長期食用低于0.1 mg/kg的含硒食物會導致人體硒缺乏反應癥，長期食用硒高于1 mg/kg的食物則會引起硒中毒[5]。硒元素在食品中的形態主要分為無機硒和有機硒，無機硒主要包括單質硒、硒酸鹽、亞硒酸鹽、揮發態的甲基硒和硒化氫[6]，有較大毒性。有機硒主要為大分子硒和以硒代氨基酸及其衍生物形式存在的小分子硒化物，大分子硒主要包括硒蛋白、硒核酸和硒多糖等，小分子硒化物包括硒甲基硒半胱氨酸、硒代高胱氮酸、硒代蛋氨酸和硒肽等。有機硒毒性遠低于無機硒，生物活性更高，富含營養，更有利于人體吸收[7]。

目前絕大多數食品標準中涉及到的硒都是總硒含量，但是這對于食品中硒的營養和毒性分析是遠遠不夠的。市面上富硒產品越來越多，為了消費者能夠吃上真正的富硒食品，享受硒元素的保健效果，建立快速、靈敏、準確的方法檢測食品、藥品及保健品等產品中的硒含量以及對硒元素形態進行分析對人類的健康和經濟發展有著重要意義[8]。

而要實現食品中不同硒元素形態的分析，首先必須建立食品中硒化物的提取、分離和檢測方法。目前，食品中硒化物的提取方法主要有水提取法、酸提取法、酶提取法、固相萃取法等[9-16]，也有使用氫氧化鈉、Tris-鹽酸緩沖液等作為提取劑的提取方法[17,18]。由于食品中硒形態的復雜性和多樣性，目前所發展的測定技術對無機硒的形態分析較為成熟，而對有機硒的形態分析方法在測定實際樣品時還要進一步完善。為此，需將各種分離方法和檢測技術進行有機結合，并且期待聯用技術的進一步發展[19]。硒化物分離檢測的主流方法包括液相色譜與原子熒光聯用法(HPLC-AFS)、液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS-MS/LC-TOF-MS)、液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用法(HPLC-ICP-MS)、氣相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用法(GC-ICP-MS)和電泳及其聯用技術等[20-23]。本實驗將運用酶解技術提取富硒食品中的硒化物并通過反向離子對高效液相色譜-電感耦合等離子質譜聯用技術對富硒食品中硒酸根(SeO42-)、亞硒酸根(SeO32-)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)5種主要形態的硒化物進行分離和檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

硒酸根溶液Se4、亞硒酸根溶液Se6、硒代胱氨酸SeCys2(98%)、硒甲基硒代半胱氨酸MeSeCys(98%)、硒代蛋氨酸SeMet(98%)、胰蛋白酶、蛋白酶K、鏈霉蛋白酶、磷酸二氫鉀(色譜純)、七氟丁酸(色譜純)、甲醇(色譜純)：美國Sigma公司；富硒酵母標準物質(產地：湖北恩施)；富硒茶(產地：湖北恩施)；富硒大米(產地：廣西河池)；富硒礦泉水(產地：陜西安康)；富硒馬鈴薯(產地：湖北恩施)；富硒小米(產地：湖北恩施)。

1.1.2 儀器

Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色譜儀、SNO2355R iCAP RQ ICP-MS電感耦合等離子質譜儀、Hypersil GOLD C8反向色譜柱 美國賽默飛世爾公司；7DFE8C7A恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；3K30離心機 美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 硒化合物的提取

本文使用在2018年6月21日發布的第一個關于食品中有機硒的國家標準GB 1903.28-2018《食品安全國家標準 食品營養強化劑 硒蛋白》中推薦的一種混合酶解提取硒化物的方法[24]：采用胰蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶在Tris-HCl緩沖液中37 ℃條件下振蕩酶解36 h，經離心、截留大分子、過濾后上機，具體步驟見圖1。

圖1 硒化物提取流程圖

1.2.2 標準溶液的制備

將5種標準溶液用去氣水配制成空白、1，5，10，50 μg/L。

1.2.3 色譜條件及儀器參數

無機硒和硒代氨基酸的極性較強，在一般的C8或C18反相柱上保留很弱，不能實現有效分離，可以通過加入離子對試劑改善目標化合物在反相柱上的保留。實驗采用Hypersil GOLD C8作為分離柱，磷酸二氫鉀-七氟丁酸-甲醇-水體系作流動相，其中七氟丁酸作為離子對試劑，磷酸二氫鉀作緩沖鹽增加了離子強度，提高了流動相洗脫能力，運用Thermo Scientific Ultimate 3000高效液相色譜與iCAP RQ ICP-MS聯用技術實現了5種Se形態的快速高效分離。iCAP RQ具有專利Flatapole碰撞反應池QCell，本實驗使用單氦氣作為動能歧視效應(KED)的碰撞氣體，選擇性地有效抑制了多原子離子對78Se+的干擾，同時能保持相聯設備(HPLC-ICP-MS)的高靈敏度。實驗中直接將柱子出口與霧化器相聯完成儀器之間的聯用。同時用通訊電纜連接到iCAP RQ ICP-MS的I/O面板，建立雙向觸發。使用Thermo Scientific Qtegra控制軟件的tQuant功能實現全部定量分析(峰面積積分、濃度、校準曲線擬合等)。具體色譜條件及儀器參數見表1和表2。

表1 5種硒化物分離色譜條件

表2 檢測儀器參數

1.2.4 標準曲線的制定

將1.2.2制備的5種硒化物同濃度標準溶液分別混合，按照1.2.3色譜條件及儀器參數進行分離檢測，記錄5種硒化物在不同濃度下的峰面積積分并分別制定標準曲線。

1.2.5 不同硒形態檢出限測定

在空白樣品中加入5 μg/L的混合標準溶液，以3倍基線噪音測定5種硒化物的檢出限。

1.2.6 回收率測定

為了驗證方法的準確度，選取富硒酵母標準物質(SELM-1)作為分析對象按照所確定方法檢測其中硒代蛋氨酸含量，對照標準品證書標稱含量計算方法回收率。

1.2.7 樣品檢測

選取市售富硒茶(樣品1)、富硒大米(樣品2)、富硒礦泉水(樣品3)、富硒馬鈴薯(樣品4)、富硒小米(樣品5)5種樣品進行硒元素含量檢測和5種不同硒元素形態的分離檢測，計算總硒的提取回收率，并對結果進行分析。

1.2.8 方法準確度驗證

為了考察方法的準確度，向市售樣品提取液中加入5種硒形態濃度同為38 μg/L的混合標準溶液，分別計算5種硒化物的回收率。

2 結果與分析

2.1 5種硒形態各濃度混合標準溶液色譜疊加圖

將5種不同硒形態標準液混合物按照1.2.3色譜條件及儀器參數進行分離檢測，將5種不同濃度標準混合液所得色譜圖進行疊加，結果見圖2。

圖2 5種硒形態各濃度混合標準溶液色譜疊加圖

由圖2可知，本文所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hypersil GOLD C8，以七氟丁酸-磷酸二氫鉀-甲醇-水為流動相等度洗脫，對5種硒形態的分離效果較好，采用常規粒徑液相色譜柱實現了在800 s內完成5種硒形態的快速分離。

2.2 5種硒形態混合標準溶液的標準曲線

按照1.2.4制定5種不同硒化物的標準曲線，5種硒化物在0～50 μg/L范圍內線性相關系數均為1.000，線性關系良好，見表3。

表3 5種硒形態標準曲線參數

2.3 檢出限的測定

0.5 μg/L混合標準溶液色譜圖見圖3，各形態峰高均≥基線噪音的3倍，SeO42-、SeO32-、SeCys2、MeSeCys和SeMet的檢出限可分別達到0.20,0.25,0.25,0.20,0.50 μg/L。

圖3 0.5 μg/L混合標準溶液色譜圖

2.4 回收率測定結果

按照1.2.6方法，測定富硒酵母標準物質(SELM-1)中硒代蛋氨酸結果及回收率，見表4。結果表明該法回收率高，回收效果好。

表4 富硒酵母標準物質測定結果

2.5 樣品檢測結果

選取市售富硒茶(樣品1)、富硒大米(樣品2)、富硒礦泉水(樣品3)、富硒馬鈴薯(樣品4)、富硒小米(樣品5)作為樣品進行硒元素含量檢測和5種不同硒元素形態的分離檢測，按照1.2所建立的方法，樣品中5種硒元素形態均能實現有效分離，結果見表5。結果表明，本實驗采用的混合酶解提取硒化物方法提取效率較高，能有效實現富硒食品中硒化物的提取，另外從結果中也可以看出5種富硒食品樣本中硒種類與含量各不相同，其營養價值及利用度值得深入探究。

表5 樣品檢測結果

2.6 方法準確度驗證結果

為了考察方法的準確度，向市售樣品提取液中加入5種硒形態濃度同為38 μg/L的混合標準溶液，分別計算5種硒化物的回收率，結果見表6。結果表明，該方法對5種不同硒元素形態回收率好、準確度高。

表6 回收率驗證結果

3 結論

本文建立了利用反向離子對高效液相色譜-電感耦合等離子質譜聯用分離檢測富硒食品中硒酸根(SeO42-)、亞硒酸根(SeO32-)、硒代胱氨酸(SeCys2)、硒甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)5種不同硒元素形態的方法，其中采用胰蛋白酶、蛋白酶K和鏈霉蛋白酶在Tris-HCl緩沖液中37 ℃條件下振蕩酶解36 h提取食品中的硒化合物。結果表明：所建立的HPLC-ICP-MS方法，采用Hypersil GOLD C8常規粒徑液相色譜柱，以七氟丁酸-磷酸二氫鉀-甲醇-水為流動相等度洗脫，實現了在800 s內完成5種硒元素形態的快速準確分析。通過市售富硒食品樣品驗證，該方法是一種有效可行的對富硒產品中硒形態的分析方法。硒元素對人體的保健功能越來越被重視，目前市面上的富硒食品種類也越來越多，此方法的建立將有助于對富硒食品中硒元素的形態和硒對人體的作用進行更深層次的研究，為國家食品監管部門建立更完善的富硒食品國家標準和富硒食品行業標準奠定了基礎，使富硒食品市場變得更加規范，為消費者更好地選擇和食用富硒食品提供了保障。