建立檢測醬油中8種生物胺的液相色譜-串聯質譜方法(LC-MS)

沙麗娜，吐爾洪·買買提，阿孜古麗·衣該木，艾買提江·阿衣甫別克，張明玥

(1.新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院，烏魯木齊 830011；2.新疆大學 化學學院 能源材料化學教育部重點實驗室，烏魯木齊 830046)

生物胺(biogenic amine, BA)是一種有生物活性的、低分子量的、含氮有機化合物的總稱。生物胺對內臟功能和免疫系統的代謝過程起著非常重要的作用，主要存在于各種各樣含蛋白質比較豐富的食物中，比如乳制品類、飲料、魚產品類和各種發酵食品。據報道，生物胺是由原料中的微生物或者酶通過代謝產生的氨基酸脫羧酶作用形成的。它不僅在各種動植物的組織中存在，也微量存在于人體中。目前雖然制定食品中生物胺禁限用標準比較困難，但部分國家已經嘗試根據不同食品的特性給出生物胺的限量標準。美國對水產品中組胺的限量為50 mg/kg，酪胺的限量范圍為100～800 mg/kg；歐盟對食品中組胺的限量為100 mg/kg，酪胺的限量范圍為100～800 mg/kg，對水產品中組胺的限量為100 mg/kg；而我國對鮐鲹魚中組胺的限量為1000 mg/kg，對其他海產魚類中組胺的限量為300 mg/kg。

醬油是一種世界流行的色、香、味俱全的液體調味品[1]，具有特殊的香氣、色澤、風味和體態[2]，是人們在日常生活中獲取鹽類的一個重要來源[3]，也是經常使用到的含有生物胺的發酵食品，有研究報道稱高含量的酪胺可能與生產醬油過程中衛生條件不好有關，同時與尸胺和腐胺的高含量有關。人類食用到的微量的生物胺一般不會對自身造成不良影響，但積累到一定程度時，在體內就會產生毒害作用，比如血壓變化、呼吸紊亂等不良反應。但是目前現行有效的醬油檢測國家標準GB/T 5009.39-2003《醬油衛生標準的分析方法》中卻沒有生物胺的相關檢測[4]，故以人體健康和食品安全為起點，建立一種簡易、靈敏、快速、高通量的生物胺含量檢測方法有重要的意義。

如目前多數方法一樣，食品中生物胺檢測現行有效的國家標準GB/T 5009.208-2016《食品中生物胺的測定》中樣品前處理需要衍生化[5-7]，有些需要固相萃取小柱凈化處理，而本次試驗采用連續三相液液萃取的前處理方法，簡單易行，毒害小。目前常用的檢測方法主要包括高效液相色譜法、生物傳感器法、氣相色譜法、氣相色譜-串聯質譜法、液相色譜-質譜法、電化學法、離子色譜法、熒光光度法、分子印跡法和紫外可見光分光光度法等[8-15]。國標檢測方法對于一些痕量的物質無法進行定量分析，故本次試驗使用液相色譜-串聯質譜法，并做了方法學試驗。該方法檢測時間短，且質譜法的檢測靈敏度要遠遠高于液相色譜法，提高了對一些含量較低的樣品檢測的準確性，尤其對一些只需要定性檢測的樣品，提供了快速簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料與試劑

生物胺標準品：色胺(純度98%)、尸胺(純度98%)、組胺(純度≥98%)、苯乙胺(純度99%)、腐胺(純度≥98%)、酪胺(純度≥98.5%)、精胺(純度≥97%)、亞精胺(純度≥98%)，均購自上海源葉生物科技有限公司；乙醇：分析純，天津市北聯精細化學品開發有限公司；甲酸銨：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；乙酸銨：色譜純，ANPEL Laboratory Technologies(Shanghai) Inc.；甲醇、乙腈：均為色譜純，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；品牌1及品牌2生抽醬油、紅燒醬油、老抽醬油、味極鮮和海鮮醬油：均購自本地超市。

1.1.2 試驗儀器

XEVO-TQS Micro型液相色譜-串聯質譜儀 美國Waters公司；CPA 225D型電子分析天平(感量十萬分之一) 德國賽多利斯公司；RP-1D型磁力攪拌器 Wiggens Labortechnik公司；DMT-2500型渦旋混合儀 Miulab公司；MAXQ4000型震蕩搖床 美國Thermo Scientific公司；Milli-Q超純水制備儀 美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備

分別稱取8種生物胺標準品各約20 mg(精確至0.00001 g)，置于10 mL容量瓶中，作為標準溶液儲備液，再分別取適量制成系列濃度為1，5，10，20，50，100 ng/mL的標準溶液，待測。混合標準溶液的總離子流(total ion chromatography，TIC)圖見圖1。

圖1 8種生物胺的混合標準溶液TIC圖

1.2.2 供試品溶液的制備

取醬油樣品3 mL加入5 mL、pH值為13的氫氧化鈉溶液中，放在轉速為500 r/min的磁力攪拌器上，用二氯甲烷進行萃取，通過選擇性透過膜后，由于濃度差進入另一邊的二氯甲烷中，最終被反萃取至濃度為0.4 mol/L的鹽酸溶液中，最后用滴管小心將混有樣品的鹽酸溶液吸取出來，過濾，待測。具體萃取裝置圖見圖2。

圖2 萃取裝置及過程圖

1.2.3 試驗條件

表1 8種生物胺的質譜檢測條件

1.3 數據處理

根據測得的供試品溶液中生物胺的峰面積值，帶入2.1得到的生物胺標準曲線回歸方程中，計算出對應的生物胺濃度，按照下式計算待測供試品中生物胺的含量ω：

式中：ω表示樣品中激素類組分的質量分數，μg/g；ρ表示從標準曲線得到待測組分的質量濃度，μg/mL；V表示樣品定容體積，mL；m表示樣品取樣量，g。

2 結果與分析

2.1 方法學試驗

2.1.1 標準曲線

按照“1.2.3”項下的試驗條件，將上述樣品及標準品溶液注入液相色譜中，進行生物胺的含量檢測，所得的生物胺的標準曲線見表2。

表2 8種生物胺的標準曲線

2.1.2 精密度試驗

取標準品溶液，連續測定6次，記錄結果數據。測定標準品溶液的生物胺含量結果的RSD(n=6)為0.30%～0.86%。

2.1.3 穩定性試驗

選取標曲中間點(即濃度為20 ng/mL左右)的標準品溶液，測量其在6，12，24，30，40，48 h時的峰面積，標準品溶液的生物胺含量結果的RSD(n=6)為2.19%～6.44%。

2.1.4 檢出限與定量限

經試驗驗證，選取標曲的最低點(約1.0 ng/mL)作為生物胺的定量限(苯乙胺因響應值較低，故其定量限約為3.0 ng/mL)；將標曲最低點精密稱取3 mL，用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容至10 mL容量瓶中，即濃度為約0.3 ng/mL作為儀器的檢出限(苯乙胺因響應值較低，故其定量限約為1.0 ng/mL)。

2.1.5 加標回收率

將8種生物胺的混合標準品溶液加入空白樣品(與醬油基質相同的純凈水)中，一般選取標準曲線中間點的濃度(本次試驗選取生物胺的濃度約為20 ng/mL)，分別平行加入6份空白樣品中，按照“1.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備，待測。得到的加標回收率的具體數據見表3。

表3 8種生物胺的加標回收率結果(n=6)

2.1.6 樣品測定結果

購買了2個品牌10個批次的醬油，其中，生抽和老抽都是經過釀造發酵加工成的醬油，紅燒醬油屬于老抽的一種；高鹽稀態發酵工藝適合制作生抽及味極鮮[16]，海天味業則以廣式高鹽稀態發酵工藝為主，該方法便于實現工業化、節約化、清潔化生產, 并且釀制出的醬油呈香濃郁、品質優良[17]；海鮮醬油是以特級生抽醬油為主料，配以經現代工藝提煉出的海魚蝦的精華液。按照“1.2.2”項下方法制成供試品溶液，按照“1.2.3”項下的試驗條件分別進行測定，記錄結果數據，結果見表4。

表4 市售10醬油中生物胺的含量(ng/mL)

由表4可知，不同品牌不同品種醬油中生物胺的種類和含量差異均較大，其中苯乙胺、腐胺和酪胺的相對含量較高，色胺和精胺的相對含量較低，但是沒有一種品牌的醬油是不含有生物胺的。有研究報道稱高含量的酪胺可能與生產醬油過程中衛生條件不好有關，同時與尸胺和腐胺的高含量有關。

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1 有機溶劑的考察

選擇合適的有機溶劑是液-液萃取過程的關鍵因素，在連續三相液相萃取中，萃取溶劑應滿足以下條件：分析物在該有機溶劑中有足夠大的溶解度；與水不互混溶，盡可量減少在萃取過程中的損失[18]；使用正L型萃取池時，有機溶劑的密度要大于水的密度，反之相反；毒性要低，避免對環境的污染及試驗操作人員的危害；與微孔濾膜不能發生作用；不與目標物發生化學反應，且穩定性好。故本次試驗中考察了二氯甲烷、氯仿和四氯化碳萃取劑對生物胺萃取效率的影響。根據試驗結果選擇萃取率最高的二氯甲烷作為提取溶劑，具體試驗結果見圖3。

圖3 不同萃取溶劑對生物胺萃取率的影響

2.2.2 微孔濾膜的考察

在連續三相液相萃取過程中微孔濾膜的選擇非常重要，微孔濾膜應該具有以下特征：微孔濾膜應該是疏水性膜；不能與有機溶劑發生相互作用；微孔濾膜的厚度要適中，微孔濾膜太厚則透過率低，引起萃取效率的下降；如果微孔濾膜太薄，在萃取過程中容易引起誤差。微孔濾膜的孔徑也要適宜；孔徑太大會導致水和其他大分子雜質物直接透過膜；如果孔徑太小會引起萃取效率的下降。試驗中考察了聚四氟乙烯(其中1號孔徑為37 μm，2號孔徑為106 μm)、聚丙烯、尼龍、不銹鋼網4種不同的膜對生物胺萃取率的影響。根據試驗結果選擇萃取率最高的聚四氟乙烯(2號孔徑為106 μm)作為微孔濾膜，具體試驗結果見圖4。

圖4 不同濾膜材質對生物胺萃取率的影響

2.2.3 給體相pH的考察

給體相與接受相pH在液-液-液三相萃取中起到重要作用。液-液-液三相體系包含給體相、有機相、接受相3個液相，對于堿性分析物通過向給體相中加入堿調節給體相的pH值大于目標物的pKa值，使目標物去離子化以降低其在給體相中的溶解度。通過攪拌使給體相中的目標分析物擴散并依靠疏水作用進入有機相，接受相中加酸是為了提供質子在有機相和接受相界面使目標分析物質子化，則被萃取到接受相[19]。本文考察了給體相10～14范圍內的pH值對生物胺萃取效率的影響。根據試驗結果選擇萃取率最高的13作為給體相的pH值，具體試驗結果見圖5。

圖5 不同給體相的pH對生物胺萃取率的影響

2.2.4 接受相鹽酸濃度的考察

鑒于接受相鹽酸濃度對生物胺萃取效率的影響，本文考察了接受相在0.1～0.5 mol/L范圍內的鹽酸濃度對生物胺萃取效率的影響。根據試驗結果選擇萃取率最高的0.4 mol/L作為接受相的鹽酸濃度，具體試驗結果見圖6。

圖6 不同鹽酸濃度對生物胺萃取率的影響

2.2.5 攪拌速率的考察

攪拌速率是影響萃取效率的另一重要因素。由于攪拌增加接觸面從而可以提高萃取效率，尤其是連續三相液相萃取中，通過攪拌增加待測組分快速透過微孔濾膜并縮短平衡時間。同時，快速攪拌可能造成萃取劑的揮發損失與產生大量氣泡從而降低萃取效率。在試驗中選擇200，300，400，500，600 r/min 5個不同的攪拌速率進行考察。根據試驗結果選擇萃取率最高的500 r/min作為攪拌速率，具體試驗結果見圖7。

圖7 不同轉速對生物胺萃取率的影響

2.2.6 萃取時間的考察

一般隨時間的增長萃取效率也增大。但時間過長，有機溶劑揮發，不利于萃取。本試驗在5～50 min時間內進行考察。根據試驗結果選擇萃取率最高的20 min作為萃取時間，具體試驗結果見圖8。

圖8 不同萃取時間對生物胺萃取率的影響

2.2.7 混勻方式的考察

一般的混勻方式有磁力攪拌、渦旋混勻及搖床振蕩3種方式，本次試驗對3種混勻方式對生物胺的萃取率比對進行了考察。根據試驗結果選擇萃取率最高的渦旋混勻作為混勻方式，具體試驗結果見圖9。

圖9 不同混勻方式對生物胺萃取率的影響

2.3 試驗條件的優化

2.3.1 色譜柱的優化

選取Waters公司的C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)、C8(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)、HILIC(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)3種不同填料的色譜柱對8種生物胺進行檢測，結果發現HILIC柱及C8柱無法完全檢測出8種生物胺，最終選擇8種生物胺均可檢出的Waters公司的C18柱。

2.3.2 耐用性的考察

分別選取①C18(50 mm×2.1 mm，內徑1.7 μm)、②C18(100 mm×2.1 mm，內徑1.7 μm)、③C8(50 mm×2.1 mm，內徑3.5 μm)、④C8(100 mm×2.1 mm，內徑3.5 μm)4種型號和規格的色譜柱，對生物胺的系統適用性進行考察，包括色譜柱的理論板數(n)、分離度(R)、拖尾因子(T)等。試驗結果顯示①C18(50 mm×2.1 mm，內徑1.7 μm)的色譜柱得到的理論板數、分離度及拖尾因子最好，因此選擇該規格色譜柱。

2.3.3 流動相的優化

選取甲醇和乙酸銨水溶液(濃度為5 mmol/L)以及乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)兩種不同的流動相對8種生物胺進行檢測，結果表明，以乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)為流動相時，8種生物胺能獲得較好的峰形、分離效果和檢測靈敏度。因此，選擇乙腈和甲酸水溶液(濃度為0.1%)作為流動相。

2.3.4 質譜條件的優化

根據儀器自動調諧的結果進樣檢測，結果發現還是有部分生物胺無法檢測出來，故需對自動調諧的結果進行微量的手動調諧，優化質譜調諧中的毛細管電壓、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量等參數，根據響應值的大小，確定最終的生物胺的質譜檢測條件。按照試驗確定的質譜方法中質譜檢測條件(8種生物胺的母離子、碎片離子、錐孔電壓以及碰撞能等條件)，對毛細管電壓、離子源溫度、脫溶劑氣流量和脫溶劑氣溫度進行4種數據的測試，并對生物胺的響應值進行檢測，最終選擇1.2.3中的質譜條件。

3 結論

采用的連續三相液液萃取法互補了膜分離和三相液液萃取技術的缺點，提高了方法的準確性、靈敏度、選擇性，并且縮短了萃取時間，裝置簡單，成本低，膜過濾和兩次萃取同時完成，且重現性好。采用的液相色譜-串聯質譜法作為生物胺的檢測方法分析時間更短(10.0 min)，檢出濃度更低(苯乙胺為1.0 ng/mL，其余7種為0.3 ng/mL)，更適用于微量生物胺的檢測。本次方法學試驗檢測結果顯示8種生物胺的線性關系良好，相關系數均大于0.99；精密度RSD范圍為0.30%～0.86%；穩定性RSD范圍為2.19%～6.44%；回收率范圍為87.02%～90.20%，說明采用此質譜方法進行檢測結果良好，對8種生物胺具有普遍適用性。通過對上述市售的10批次醬油的檢測，證實本試驗的樣品提取方法簡單、快速，可用于醬油中8種生物胺的檢測，同時可以繼續推廣作為紅酒、牛奶、飲料及果汁等其他液態食品中8種生物胺的檢測方法。